人巨细胞病毒UL136编码蛋白相互作用蛋白的筛选及功能研究.pdfVIP

·中文论著摘要· 人巨细胞病毒ULl36编码蛋白相互作用蛋白的 筛选和功能研究 目的 人巨细胞病毒(Human 可引起新生儿多种畸形和疾病，也可引起免疫低下患者的致死性感染，其危害巨 大。有学者推测HCMVUL／b’区可能在病毒的复制、潜伏和对宿主的致病性方面 起重要作用，因而UL／b’区基因及编码蛋白在HCMV感染和致病性方面受到特殊 关注。位于UL／b’区内的ULl36基因具有相应的mRNA结构，其编码蛋白分子量 约为27．3KD的碱性蛋白，目前其编码蛋白的功能仍不清楚。本文从酵母双杂交筛4 选、Pull--down、激光共聚焦技术三个方面对HCMVULl36编码蛋白相互作用蛋 白进行了筛选和功能研究。 实验材料与方法 一、实验材料 标本来自中国医科大学附属盛京医院病毒室保存的临床低传代HCMV分离 GAL 株H株(传代次数5次)。Matchmaker Two—Hybrid Purification Pull-down System、MagneGSTTM 分析软件如基因组数据库、蛋白质分析数据库、引物设计软件等。 ， 二、实验方法 (一)酵母双杂交筛选 1、以HCMV 。／ 构建西GBKT7．ULl36重组质粒，PCR鉴定，并测序分析验证。 板上，30C培养至菌落长出，以X．g甜筛选蓝色的阳性克隆。 3、提取酵母阳性质粒。电窒至垒整化到大肠杆菌TGl中，在含氨苄青霉素的 培养基中筛选出含eDNA文库的阳性克隆。进行回转验证，观察其在四缺培养基 上的生长状况。 析。最终筛选出的文库质粒为pACT2．ATPlBl。 (二)Pull．down技术鉴定 ． ATPlBl。 进行体外转录；提取在大肠杆菌中表达的pGEX．ATPlBl蛋白，作为诱饵蛋白将 Pull．down 其固相化到MagneGSTTMParticles上，按照MagneGSTTMSystem操作进 行，将两种蛋白共同孵育，洗脱，纯化，Westernblot技术分析相互作用的蛋白 复合物，ECL化学发光法鉴定结果，分析。 +(三)激光共聚焦技术的细胞定位分析 用同样的方法将筛选得到的文库质粒克隆到含有红色免疫荧光标记的pDsRed．C1 载体上，构建重组质粒pDsRed．ATPlBl。并测序分析验证。 白表达及定位情况。 孛士里 拿口7代 一、酵母双杂交 2 l、用特异性引物成功扩增出HCMV ULl36基因片段，片段长度为723bp并 测序分析显示结果与预期一致。测序结果表明融合区域的读码框正确，经测序证 实为HCMVULl36序列且无碱基突变。 3、对验证后阳性克隆质粒测序和生物信息学分析共获得以下4个候选基因： VATl，编码一种囊泡胺转运蛋白同系物；WDRl，编码色氨酸．天冬氨酸重复序 列结构域；C1 ATP酶的p亚基，其中筛选的阳性克隆与ATPlBl高度同源，同源性99％。 二、Pull-down技术鉴定 框架正确，克隆到含有GST标签的pGEX．4T．2载体上，PCR鉴定，测序分析， 克隆成功。 胶电泳分析，ATPlBl融合蛋白成功表达。 Pull—down 3、按照MagneGSTTM System操作，将含有c-Myc标签的 blot检测，结果发现两种蛋 孵育，洗脱，纯化，通过抗c．Mye抗体进行We