冠心平对急性缺血犬心肌细胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达影响.docVIP

冠心平对急性缺血犬心肌细胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达影响摘 要：目的：研究冠心平对冠脉结扎导致心肌缺血犬心肌细胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响。方法：36头Beagle犬，分成假手术组，心肌缺血模型组，心可舒组，小、中及大剂量冠心平组。前两组分别给予空白胶囊，其他各组每日两次口服相应剂量的药物，连续给药10天，10天后进行冠状动脉结扎实验。结扎180min后取心肌切片保存，检测心肌细胞凋亡指数（AI），并用免疫组化法检测心肌组织Bcl-2、Bax蛋白的表达。结果：与模型组相比，心可舒组及冠心平小、中、大剂量组的心肌凋亡指数水平均有所下降，Bcl-2蛋白表达增强，Bax蛋白表达减少，与模型组比较均具有统计学意义（P 健康Beagle犬，雌雄兼用，体重（10±2）kg，由扬州四方实验动物科技有限公司提供，合格证号：SCXK（苏）2008-0006。 1.3 实验仪器 ①动物呼吸机：ALC-V10，上海奥尔科特生物科技有限公司；② SP-756PC型紫外分光光度计：上海光谱仪器有限公司；③ LDZ5-2型离心机：北京京立离心机有限公司；④ TP 1020自动脱水机：德国LEICA公司产品；⑤RM2235型石蜡切片机：德国LEICA公司产品；⑥Tissue-Tek TEL组织包埋中心：日本SAKURA公司产品；⑦LEICA DM-1000光学显微镜：德国LEICA公司产品；⑧MiniSee图像采集系统；⑨康克新柏图文分析软件。 2实验方法 2.1 分组与剂量 取健康Beagle犬36只，雌雄兼用，随机分为6组，每组6只。假手术组和心肌缺血模型组每日两次口服空白胶囊，其他各组每日两次口服相应剂量的药物，连续给药10天，10天后进行冠状动脉结扎实验。给药剂量分别是心可舒组为0.36g/kg；冠心平大剂量组为6.7g/kg；冠心平中剂量组为3.35g/kg；冠心平小剂量组为1.675g/kg。 2.2 造模[7-8]及检测指标 取健康Beagle犬，称重后以2%戊巴比妥钠30mg/kg小隐静脉注射麻醉，背位固定，监测肢体Ⅱ导联心电图。切开颈部皮肤，气管插管，连接动物呼吸机，维持正常通气。分离股动脉、股静脉。股动脉插管并与压力换能器相连监测平均动脉血压、心率变化。股静脉插管，滴注0.9%氯化钠注射液。然后右侧卧位固定，于左侧第4肋间开胸，暴露心脏，分离冠状动脉左前降支（LAD）第二分支处穿线以备结扎用，行冠状动脉两步结扎法，建立Beagle犬急性心肌缺血模型。假手术组只穿线不结扎，冠心平各剂量组和阳性对照组的操作方法与模型对照组相同。结扎15min后经十二指肠给予已配制好的等体积实验药物或生理盐水。完全结扎180min后，取下心脏，生理盐水冲洗，在冠状动脉结扎线下1cm处，取少许左室前壁心肌组织，用10%福尔马林液固定后，分别进行心肌组织病理观察、TUNEL法检测坏死心肌细胞凋亡指数（AI）及免疫组化法检测Bcl-2、Bax基因蛋白表达。 2.3心肌组织病理形态观察 10%福尔马林固定后的心肌组织，每组随机取6个标本，脱水透明，石蜡包埋，常规切片4μm。苏木素-伊红染色（HE）法染色。光镜下观察各组形态学改变。 2.4心肌细胞凋亡检测 应用改良的末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记（TUNEL）法，原位标记心肌凋亡细胞核中的脱氧核糖核苷酸片段3-OH末端显示心肌凋亡细胞的存在。正常心肌细胞核呈蓝色，而凋亡阳性心肌细胞核呈棕黄色。每只犬取6张切片，按说明书操作。阳性对照用双蒸水代替试剂盒中的反应混合物，不用苏木素复染，其余步骤不变。每张切片计数5个高倍镜（×400）视野中的凋亡阳性细胞核数、总细胞核数，取其比值的平均值为AI。 2.5 心肌Bax和Bcl-2基因蛋白表达检测 采用SP免疫组化法检测Bax和Bcl-2蛋白表达，以PBS替代一抗为阴性对照。具体方法按试剂盒说明书进行操作。每张切片随机测定5个视野取平均值，以其作为切片的测定值。Bax和Bcl-2蛋白表达均位于心肌细胞浆，呈棕黄色颗粒状。所有标本均采用捷达图像分析系统进行吸光度值（A值）测定。切片阳性表达的强弱与A值呈正相关，A值大则阳性表达强，反之依然。 2.6 统计学处理 统计学处理数据用（±s）表示，采用t检验，用 SPSS 16.0统计软件进行统计分析。 3实验结果 3.1心肌组织病理学变化 假手术组心肌形态规则，排列整齐，细胞未见水肿变性，间质未见炎细胞浸润及纤维组织增生，模型对照组主要表现局部区域心肌梗死，梗死区心肌纤维溶解断裂，呈小片状或小灶性坏死，周围有较多淋巴细胞浆细胞浸润，并见肉芽组织形成，部分区域纤维组