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刺梨茎尖玻璃化超低温保存及植株再生摘要： 【目的】建立刺梨茎尖超低温保存技术体系，为刺梨种质资源的长期稳定保存提供新途径。【方法】以刺梨为材料，研究了适合茎尖超低温保存的蔗糖预培养时间与浓度、预处理时间、玻璃化液处理时间等影响因素。【结果】适合超低温保存芽诱导的适宜培养基为MS+0.5 mg·L-1 6-BA+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1琼脂。刺梨茎尖玻璃化法超低温保存体系为：约0.5 cm长的腋芽茎尖在4 ℃条件下于培养基MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.05 mg·L-1 IAA +0.3 mo1·L-1蔗糖+7 g·L-1琼脂上预培养3 d，切取约2 mm长的茎尖，室温下LS装载液处理40～50 min，然后用玻璃化液PVS2 于0 ℃下处理40 min，换入新鲜的PVS2，迅速投入液氮中。保存24 h后，在40 ℃水浴中化冻，用MS+1.2 mol·L-1蔗糖+100 mg·L-1 Vc+0.5 mg·L-1 GA3培养基洗涤2次，接种到MS+0.3 mol·L-1蔗糖的培养基上暗培养1 d，再转接到MS+0.1 mg·L-1 6-BA+0.05 mg·L-1 IAA+30 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1琼脂上暗培养7 d后转入正常光下培养，成活率可达44.3%。【结论】建立了刺梨茎尖超低温保存技术体系。 关键词： 刺梨； 茎尖； 超低温保存； 玻璃化法 中图分类号：S661.2 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2012？雪06-1069-05 2 结果与分析 2.1 刺梨无菌材料的建立 2.2 不同浓度6-BA对刺梨微茎尖培养的影响 2.3 预培养蔗糖浓度对超低温保存结果的影响 2.4 预培养时间对超低温保存结果的影响 2.5 装载液（LS）预处理时间对超低温保存结果的影响 装载预处理是一个渗透保护的处理过程，可以初步降低组织的含水量，避免由于渗透压变化太强而对材料造成伤害[1]。 图3结果显示，LS装载液预处理对超低温保存效果有明显的影响。不经过装载液处理的茎尖几乎 2.6 玻璃化液（PVS2）处理时间对超低温保存结果的影响 2.7 解冻后的形态发生与植株再生 3 讨 论 在植物茎尖超低温保存研究中，大多以继代苗的茎尖作为保存材料[1，11-13]，可能是因为通过继代培养可以提高细胞分裂与分化的同步化频率，从而提高超低温保存的存活率。但本研究中，刺梨继代苗的茎尖长势弱，茎尖不明显，而采用初代诱导苗的腋芽大、健壮，茎尖明显，适合作超低温保存材料，这在葡萄[5]、柿[12]离体茎尖超低温保存中，也发现顶芽茎尖保存后不易成活，而腋芽茎尖保存后再生率较高的现象。要使保存后的茎尖能够成活，茎尖的大小要适当。过大不利于脱水，过小易造成机械损伤。因此，在剥取茎尖时，一定要尽量减少机械损伤，这也是刺梨保存成功的关键。本试验切取刺梨茎尖长度为2 mm左右，保存效果较好。 一般情况下，在进行植物茎尖超低温保存前，对材料进行预培养，可以提高超低温保存后的成活率。用高浓度的蔗糖进行预培养是较为常用的方法，但本研究先期仅选用高浓度蔗糖进行预培养，保存效果不好，成活率低。而改用高浓度蔗糖结合低温（4 ℃）对刺梨茎尖进行预培养，保存效果较好。预培养除了要求方法适当外，预培养的时间也要适宜。本研究预培养3 d，保存效果较好，而预培养时间过长或过短，则成活率都会降低，这与前人研究结果一致[9，13]。此外，蔗糖浓度过高或者预培养时间过长，材料会出现黄化、水渍化和生活力降低甚至死亡的现象，可能是由于材料脱水过度、细胞产生了渗透胁迫所致。 本研究发现，在恢复培养时不进行暗培养或暗培养时间少于7 d，刺梨茎尖几乎不能成活，因此，恢复培养初期进行一定时间的暗培养至关重要。在桃茎尖超低温保存过程中也发现，化冻后的茎尖通过15 d的暗培养后，可显著提高其成活率，若直接在光下培养，成活率极低[13]。在刺梨茎尖恢复培养初期，进行更长时间的暗培养是否还可提高其成活率，有待进一步研究。 本研究对刺梨茎尖的超低温保存取得了重要结果，但其保存后成活率还比较低，还需对超低温保存的程序和方法进行优化。（本文图版见插2） 参考文献 References： [1] FANG Xiu-gui， LI Si-biao. ZHENG Yi-qing. The nutritive value of Rosa roxburghii Tratt and itsdevelopment and utilization[J]. Science and Technology of Food Industry， 2004， 25（1）： 137-138. 方修贵，李嗣彪，郑益清. 刺梨