反义TIMP-1表达质粒对实验性肝纤维化影响.docVIP

反义TIMP-1表达质粒对实验性肝纤维化影响[摘要]目的：观察反义TIMP-1真核表达质粒对实验性肝纤维化的影响。方法：运用重组DNA技术及反义技术，构建反义TIMP-1真核细胞表达质粒，经脂质体包埋，将其导入实验性肝纤维化大鼠模型体内，通过半定量RT-PCR，病理形态学观察及western bloting免疫印记技术，观察反义TIMP-1表达质粒对大鼠肝纤维化的影响。结果：反义TIMP-1质粒组与肝纤维化组、空质粒组相比TIMP-1mRNA、MMP-13mRNA及蛋白表达明显减少（P0.05）；正常对照组与各实验组之间的病理学分级有显著性差异（P0.05）。结论：反义TIMP-1/pcDNA3.1（+）真核细胞表达质粒使TIMP-1mRNA、MMP-13mRNA及蛋白的表达受到抑制，反义TIMP-1表达质粒对肝纤维化有较好的改善作用，为以后肝纤维化的基因治疗奠定基础。 [关键词]肝纤维化；反义基质金属蛋白酶抑制因子-1；基质金属蛋白酶-13 肝纤维化主要是由于细胞外基质（ECM）降解减少导致ECM沉积增多而形成，细胞外基质的降解受基质金属蛋白酶-基质金属蛋白酶抑制剂（MMPs-TIMPs）系统的调节。基质金属蛋白酶（MMPs）在降解纤维化肝脏过多细胞外基质（ECM）的过程中起主要作用，其中间质胶原酶 （人MMP-1，鼠MMP-13）在降解纤维化肝脏ECM过程中起重要作用[1]。本研究构建了反义pcDNA3.1（+）/TIMP-1真核表达载体，将其导入到复合因素复制的实验性肝纤维化大鼠体内，观察pcDNA3.1（+）/TIMP-1真核表达质粒对实验性肝纤维化的影响。 1材料与方法 1.1、材料 正常纯种系SD大鼠60只，雌性，体重200～300g。脂质体Lipofectmine2000、Trizol Reagent、UNIQ-200大剂量质粒抽提试剂盒、UNQI-10柱式PCR切胶回收试剂盒。一步法RT-PCR试剂盒、T4DNA连接酶、限制性内切酶Xholl、EcoRI等。 1.2、反义质粒的构建和鉴定 根据TIMP-1cDNA序列设计PCR扩增引物，取正常大鼠肝组织，用TRIzol法提取总RNA，检测RNA完整性、浓度和纯度，OD260/OD280在1.8～2.0之间。用一步法RT-PCR试剂盒获得目的基因TIMP-1cDNA片段，采用巢式PCR扩增TIMP-1基因片断。并纯化回收PCR产物，使用限制性核酸内切酶EcoRI、XholI双酶切pcDNA3.1（+），线性化pcDNA3.1（+）纯化回收后和TIMP-1基因片段定向及反向连接，构建以pcDNA31（+）为载体的反义TIMP-1基因真核表达质粒。诱导感受态细胞，转化JM109大肠杆菌。酶切证实的阳性克隆送上海生物工程公司测序分析。 1.3、大鼠肝纤维化模型制备及质粒导入 雌性SD大鼠60只，体重200~300g，随机分为4组：反义TIMP-1治疗组（14只）、pcDNA3.1（+）空质粒组（17只）、肝纤维化组（17只）、正常对照组（12只）。采用CCl4复合法制备大鼠肝纤维化模型，造模结束后，治疗组按反义TIMP-1/pcDNA3.1（+）重组质粒100micro;g，空质粒组给予pcDNA3.1（+）质粒100micro;g经腹腔导入大鼠肝纤维化模型体内，同时正常对照组腹腔注射等量的0.9%的生理盐水。每9天1次至第8周，共注射5次，8周末时。 1.4、结果观察 实验动物第8周结束后，乙醚吸入麻醉，取部分肝组织迅速放入液氮中速冻后，-70℃保存备用，部分肝组织置于10%甲醛溶液中固定，作病理学检查。 1.5、病理形态学观察 对肝组织切片进行HE、VG染色，对各实验组肝组织的病理学形态进行观察，根据王宝恩等[2]肝纤维化分级标准对各实验动物的肝组织切片进行病理学分级。 1.6、运用RT-PCR半定量检测肝组织内TIMP-1mRNA，MMP-13mRNA的表达。 1.7、westernbloting印记技术检测大鼠肝组织中MMP-13及TIMP-1蛋白表达 1.8、统计学方法 计量资料采用样本均数±标注差，采用SPSS软件做方差分析（多个样本均数的两两比较），等级资料病理形态学分级结果作Ridit分析，P0.05 2.2、各组大鼠肝组织中TIMP-1mRNA及蛋白的表达 各组大鼠肝组织中TIMP-1mRNA及蛋白的相对表达量TIMP-1/β-actin、TIMP-1蛋白表达量（TIMP-1/β-actin灰度值）如下图（表3）示 表3各组大鼠肝组织中TIMP-1mRNA及蛋白的表达（±S） 组别 n TIMP-1/β-actin TIM