硫化氢在PI3kAkt通路对大鼠肝细胞增殖、凋亡的作用中的作用.pdfVIP

The role of exogenous hydrogen sulfide in hepatocytes proliferation and apoptosis via PI3k/Akt pathway A Dissertation Submitted to Shihezi University In Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Medicine By YueYalun (Internal medicine) Dissertation Supervisor: Prof. Zheng Yong May,20 15 万方数据 万方数据 摘要 目的： 探讨硫化氢（H S）对肝纤维化大鼠肝细胞增殖、凋亡的影响，研究PI3K/Akt 信号通路在H S 2 2 影响肝纤维化大鼠肝细胞(HC)的增殖、凋亡中的作用，探讨H S 是否通过 PI3K/Akt 信号通路调节 2 肝细胞的增殖、凋亡及胶原蛋白的表达，从而延缓肝纤维化的发生。 方法： （1）采用 40% 四氯化碳棉籽油背部皮下注射联合高脂肪高胆固醇饲料及酒精的复合因素法建 立肝纤维化大鼠模型。（2 ）采用胰酶两步灌流法提取肝纤维化大鼠的肝细胞。（3 ）提取的原代肝 细胞用MTT 法测定NaHS 和LY294002 对大鼠肝细胞的增殖抑制率（IR ），分对照组与实验组，实 验组按照加药浓度梯度分组：NaHS 组分别按照 25 µmol/L 、50µmol/L 、75µmol/L、100µmol/L、 200µmol/L 浓度梯度给药，LY294002 组分别按照 25 µmol/L、50µmol/L、75µmol/L、100µmol/L、 200µmol/L 的浓度梯度给药，均干预48 小时，加入 MTT 20µl 暗处反应4 小时，加入DMSO150µl 终止反应，使用酶标仪于570nm 波长处检测各孔吸光度（A ）值。（4 ）Hoechst33342 染色检测H S 2 与 LY294002 对肝细胞凋亡的影响：分 4 组，正常对照组（N ）、NaHS50µmol/L 组（S ）、 Lmol/L +NaHS 50µmol/L 组(LYS)、Lmol/L 组(LY)，倒置荧光显微镜下观察 并计算肝细胞的凋亡率。（5 ）western-blot 检测PI3k 、Phospho-bad 蛋白的表达量：分4 组，正常对 照组（N ）、NaHS50µmol/L 组（S）、Lmol/L +NaHS 50µmol/L 组(LYS)、Lmol/L 组(LY)，计算目的蛋白灰度值与β-actin 蛋白灰度值的比值。（6 ）PCR 法检测肝细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶 原mRNA 的表