成新艳20135185基因工程作业教案.docVIP

生命科学与工程学院 大学生创新实践项目申请书 项目名称：利用基因工程使家蚕丝腺生物反应器表达狂 犬病病毒核蛋白p 申 请 人： 成新艳 p 专业班级 p 联系电话： P 申报日期： 2015 年 12 月 15 日 一、项目基本信息 狂犬病是由狂犬病病毒引起的一种急性致死性疾病，可侵染几乎所有温血哺乳动物，死亡率可达100%。采用家蚕丝腺生物反应器这一蛋白高效表达系统，尝试建立一种高效、低廉、稳定生产狂犬病病毒核蛋白（RVNP）的技术体系，为生产基因工程疫苗奠定基础。通过RT-PCR方法克隆获得RVNP序列，采用家蚕丝胶蛋白基因（Ser1）启动子为特异性启动子，将RVNP构建到含有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）筛选标记基因的piggyBac转座子表达载体（pBA3EGFP）中，并采用显微注射转基因家蚕技术构建家蚕丝腺生物反应器。 二、立项依据 狂犬病是由狂犬病病毒(RV)引起的一种急性致死性疾病，可侵染几乎所有温血哺乳动物，死亡率可达100%（Abe C et al,2001)。目前，注射疫苗是预防狂犬病最有效的方法。狂犬病病毒核蛋白（RVNP)是RV中保守性最强的免疫原性结构蛋白，能够刺激机体产生抗体（殷震等，1997）。目前，用于人或动物狂犬病预防的疫苗主要是用常规方法生产疫苗，但该疫苗质量不稳定，免疫效果达不到要求。因此，研制更加稳定、安全、高效、经济和使用方便的新型狂犬病疫苗已成为当前研发的热点。 RVNP蛋白是RV病毒中最稳定的蛋白，在RV复制过程中与其基因组RNA紧密结合形成核糖核蛋白(RNP），保护核酸免遭核酸酶的分解。不同毒株间的RVNP蛋白序列存在同源性及高度一致的抗原性，可以引起强烈的抗原-抗体反应，也是犬感染RV或接种RV疫苗后血清中产生抗RV病毒免疫抗体中形成最早、持续时间最长的抗体之一（殷震等，1997）。蔡月琴等尝试在大肠杆菌中表达RVNP，原核表达系统具有操作简单、生产成本低、周期短等优点，但该系统表达的蛋白与天然蛋白存在抗原性差异，并且易形成包涵体，不易纯化。杨卉娟等构建了表达RVNP和RNGP（狂犬病病毒糖蛋白）2种蛋白的重组质粒，在中国仓鼠卵巢细胞（CHO-KI）中表达了这2种蛋白，但CHO-KI培养成本高，外源蛋白表达量低。 由于家蚕生长周期短，丝腺合成、分泌蛋白功能强，外源蛋白可以获得生物学的修饰加工，并可以随家蚕吐丝而分泌到体外，便于提纯，而且家蚕已经丧失飞行能力，实验安全。因此，自转基因家蚕技术建立以来，利用转基因家蚕丝腺生物反应器生产外源蛋白已成为当前国内外研究和开发的热点，并获得了很多研究结果。 因此，研究如何采用家蚕丝腺生物反应器这一蛋白高效表达系统，尝试建立一种高效、低廉、稳定生产狂犬病病毒核蛋白（RVNP）的技术体系，可为生产基因工程疫苗奠定基础，而该系统也有望成为高效、低廉、稳定地生产狂犬病基因工程疫苗的技术体系之一。 主要参考文献 四、拟采取的研究方案 1.通过RT-PCR方法克隆获得RVNP序列。 采用狂犬病病毒ERA毒株作为目的基因的供体。分离克隆鉴定阳性重组子采子受体细胞外源基因在受体细胞中表达 → →→ → → → →→ → → → → 六、计划研究进度 2016年1月1日-10日沸水退火合成产物，构建重组DNA分子，构建转基因质粒pBSer1RVNP-A3EGFP。 2016年1月11日-22日采用显微注射转基因家蚕技术构建家蚕丝腺生物反应器，培养已转入转基因质粒pBSer1RVNP-A3EGFP的蚕卵。 2016年1月23日-3月25日诱导外源基因在受体细胞中表达 2016年3月26日-29日提取后部丝腺组织基因组DNA，PCR检测。 2016年3月30日-4月5日Inverse PCR检测，分析插入位点。 2016年4月6日-15日RVNP表达产物的SDS和Western blot检测，并证实外源RVNP