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3-MA抑制自噬在胰腺癌细胞抵抗失巢凋亡中的作用 中山大学附属孙逸仙纪念医院消化内科 学位申请人：庄燕妍 导师：张世能教授 摘 要 研究背景 cancer)是一种常见的消化道恶性肿瘤，其恶性程度高， 胰腺癌(pancreatic 疾病进展快，早期转移率高，中位生存期短，5年生存率不超过5％，死亡率接近 发病率，预后恶劣。由于胰腺癌发病的隐蔽性，缺乏早期的临床表现及症状的非 特异性，因此确诊时往往已属晚期，丧失根治性手术的机会，即使是早期诊断并 行了根治手术的病人，长期生存率仍低于15％，且存在术后容易复发的问题。大 部分临床患者仅能行姑息手术结合术后辅助化疗或者直接放化疗，不幸的是，胰 腺癌对放化疗并不敏感。胰腺癌预后差、容易复发的主要原因正是其早期转移率 高，因此，防治胰腺癌转移是关键。 正常上皮细胞具有黏附依赖性，失去细胞问或细胞与基质接触将导致细胞程 序性死亡，即失巢凋l=(anoikis)。失巢凋亡被认为普遍参与机体发生、发育、更 新及退化的全过程，例如体内的各种空腔组织如肠管等的形成，此外还可防止脱 落的细胞种植并生长于其他不适宜的地方，对于维护组织内环境稳定和结构完整 具有重要意义。但当这种生理诱导机制发生异常则会导致疾病病理过程的发生， 如目前认为失巢凋亡也参与心血管疾病及某些皮肤疾病的发生。而其在肿瘤侵袭 转移过程中的关键作用是目前研究的热点之一。目前认为，肿瘤细胞尤其是恶性 程度高的肿瘤细胞具备抵抗失巢凋亡的能力。肿瘤转移是个多阶段的过程，涉及 基质降解、肿瘤细胞游走浸润、肿瘤细胞再黏附等过程，当肿瘤细胞由于某个基 因缺失、突变或者某个凋亡信号通路的缺陷而具备了抵抗凋亡的能力，则在其脱 离原发灶进入血液或淋巴循环系统，失去基质支持，发生侵袭转移时即不发生失 巢凋亡，从而实现远处重定植形成转移灶的过程，这个结论在卵巢癌、口腔鳞癌、 肠癌、肺癌等癌细胞体外培养实验都得到了证实。基于胰腺癌恶性程度高及早期 转移、易复发的特点，我们推测其可能具备较强的抵抗失巢凋亡的能力。 自噬(autophagy)是细胞利用溶酶体降解自身大分子物质和受损的细胞器的 生物学过程，它是细胞维持自稳、保证生存的重要方法之一，尤其是细胞在面临 缺氧、营养供应不足、生长因子缺乏等不利条件时，其往往通过增加自噬活性 来保证细胞的生存。根据细胞内底物运送到溶酶体腔方式的不同可分为：大自 噬、小自噬及分子伴侣介导的自噬。正常上皮细胞具有基础水平的自噬，且自 噬与感染免疫、肿瘤耐药等也有关。研究表明，多个基因及信号途径参与自噬作 要途径，因此推测，当细胞处于失巢的不良环境时，细胞可以通过作用彼此共 同的途径P13UAKT途径来增强自噬水平缓解代谢压力、维持细胞生存抵抗失 巢凋亡。 抑制剂，能抑制胞浆型LC3I向自噬体膜蛋白LC3II的转化从而抑制自噬的激 活。因此，本实验利用3-MA抑制自噬并通过研究胰腺癌细胞的凋亡率、增殖、 迁移了解自噬在其中发挥的作用。 研究目的 通过软琼脂培养法及poly—HEMA悬浮培养法模拟胰腺癌细胞失巢状态，并使 用自噬抑制剂3．甲基腺嘌呤(3．MA)抑制细胞自噬水平，检测凋亡率、细胞增殖、 迁移能力，观察自噬在胰腺癌细胞抵抗失巢凋亡中的作用及其对增殖、迁移的影 晌，从而开辟遏制胰腺癌抵抗失巢凋亡能力的新途径，为防治胰腺癌转移寻找新 的靶点。 材料和方法 实验材料： 胰腺癌细胞系PANCl、SWl990为中山二院消化内科保存，永生化胰腺导管 n 上皮细胞H6C7为由加拿大安大略癌症研究所惠赠；自噬抑制剂3-MA购自 Merck公司；poly—HEMA、羊抗兔一FITClgG购自Sigma公司；LC3多克隆兔抗 入抗体购自Abeam公司，低熔点琼脂糖购自Amerseo公司。 实验方法和分组： l、细胞培养 培养基。 永生化胰腺导管上皮细胞H6C7：常规培养在KSFM培养基。 3-MA)2：悬浮对 2、实验分组：I：悬浮处理组(5mmol／l，10mmol／l，20mmol／I 照组3：贴壁处理组4：贴壁对照组。 3、软琼脂培养基培养