4℃冷藏血小板生物学性质的实验探究.pdfVIP

复旦大学硕士研究生论文 4C冷藏血小板生物学性质的实验研究 中文摘要 研究目的：本研究通过体外质量评价指标、THP-1细胞吞噬试验和动物体内实验 比较4C冷藏血小板与22℃室温保存血小板的生物学性质的差异，并对血小板回 输体内后被吞噬清除的分子机制进行了探讨。同时还研究了几种低温保护剂对冷 藏血小板的影响。 材料与方法：(1)取单采血小板样品，均分为两份，分别在4C和22C条件下保 存。在0d和5d时检测体外质量评价指标血小板计数、平均血小板体积、PH值、 血小板聚集率、低渗休克率等，观察两种保存条件下的变化差异。(2)在1d、 3d、5d、7d、lOd检测GPIbQ平均荧光强度(MFI)和P一选择素表达百分率(％)， 观察变化趋势和差异。(3)取单采血小板样品，均分为两份，分别在4C和22℃ 条件下保存，第3d或5d时检测THP-1细胞对其的吞噬率以及表面糖蛋白分子 GPIb Q、P一选择素的表达，观察吞噬率与分子表达的相关性。(4)在(3)的吞 噬体系中加入200ram的N一乙酰葡萄糖胺，观察吞噬率的变化。(5)用地塞米松多 次注射昆明鼠建立免疫抑制动物模型，用碳粒廓清试验评价模型的可利用性。并 建立鼠血中人血小板的流式细胞仪检测方法。(6)给地塞米松免疫抑制小鼠输注 新鲜和4℃、22℃分别保存2d的血小板，在输注后15min，2h，4h，8h眼眶取血， 以15min时鼠血中检出的人血小板为100％，计算各时间点人血小板的回收率。(7) 取1d的血小板以65％的比例加入添加液(PAS-R2)，并在其中分别添加海藻糖、 DMS0和葡萄糖，4℃冷藏保存2d时，取样做THP一1细胞吞噬试验和小鼠输注实 验，检测吞噬率和血小板回收率：冷藏7d时，检测体外质量指标，观察保护剂 对血小板的冷藏保护的作用。 结果：在血浆中保存5d后，4C保存的血小板计数、pH值与室温保存血小板无 显著差异(P0．05)。平均血小板体积显著高于室温保存的血小板(P0．05)；低 渗休克率显著低于室温组(P0．05)；ADP诱导的血小板聚集率显著高于室温组 (PO．05)。观察在血浆中保存ld-lOd的血小板，室温保存的血小板GPIbQ的 平均荧光强度(MFI)呈现逐渐下降的趋势，而冷藏血小板的表达未见显著变化； 两种温度条件下保存的血小板随时间延长P一选择素表达均呈逐渐增加趋势，且 1 复旦大学硕士研究生论文 保存期末室温组表达显著高于冷藏组(PO．05)；血浆中冷藏保存5天的血小板， THP-l细胞对室温组和冷藏组的吞噬率均随GPIba荧光强度的增强而降低 组吞噬率均显著降低(PO．05)。地塞米松免疫抑制小鼠碳粒廓清试验表明，地 塞米松小鼠的廓清指数(K)和吞噬指数(a)均显著低于对照组(P0．05)：给 地塞米松小鼠输注新鲜的和分别在4℃和22℃保存2d的血小板，结果表明，22℃ 保存血小板的与新鲜血小板在输注后2h、4h和8h的血小板回收率有显著差异 明，添加葡萄糖对吞噬率无显著影响；添加DMSO吞噬率有所下降，但无显著差 异(PO．05)；而添加海藻糖则能显著降低血小板吞噬率(P0．05)。小鼠输注实 验的8h回收率显示，添加DMSO与对照组有显著差异(PO．05)，而葡萄糖和海 藻糖则无显著差异；保存7d时检测血小板的体外质量指标发现，添加葡萄糖组 的HSR，GPIba表达的MFI显著低于对照组(P0．05)，葡萄糖消耗和乳酸生成 显著高于对照组(P0．05)；添加DMSO组的PH，GPIbQ的MFI显著均高于对照 组(PO．05)，而添加海藻糖组的体外指标与对照组无显著差异(PO．05)。 结论：冷藏对血小板造成的损伤与22℃室温保存不同，主要表现在：1)血小板形 态发生不可逆的改变，血小板平均体积显著增大：2)低渗休克率显著下降，血 小板膜的完整性受到破坏；3)血小板聚集率显著高于22℃保存血小板4)相对 于冷藏血小板，室温保存血小板的识别清除主要依赖于GPIbff的表达，而冷藏 血小板可能还存在其他途径；N一乙酰葡萄糖胺可特异性的阻断THP-1细胞对冷藏 或室温保存血小板的吞噬。地塞米松免疫抑制小鼠模型，可用于评价人血小板输 注后的体内回收率。低温保护剂海藻糖和DMSO可能对冷藏血小板有一定的保护 作用；冷藏条件下血浆中携带的葡萄糖足以维持血小板代谢需求，额外添加