产中性蛋白酶芽孢杆菌的选育.doc

产中性蛋白酶芽孢杆菌的选育 摘要：紫外诱变方便易操作，所以本实验选用紫外诱变的方式对分离纯化到的菌株进行诱变，以获得具有较高酶活性或产酶较多的产中性蛋白酶菌株。本实验对纯化得到的菌株进行LB培养基活化，得到代谢旺盛，酶系活跃的活化菌株，功率15W紫外灯30cm处照射照射分别照射1min、3min，将得到的诱变菌液进行10倍梯度稀释，取10-3~10-6梯度菌液涂布于固体牛奶培养基上，37。C培养24h，另设一组未经紫外诱变的对照，同样条件下培养。结果发现，未经诱变的培养基中，-3培养基中出现较多菌株，而-4、-6均无菌株，-5中仅出现一株菌株。经紫外诱变照射1min的 关键词：紫外诱变 活化 培养 蛋白酶 引言：从自然环境中分离，经简单筛选而获得的产酶菌株，虽然具备了一定的产酶能力，但是要达到某种特定代谢产物的大量积累，实现高产、优质和低耗的高效转化则需要对菌株进行改良，解除或突破微生物的代谢调控【1】。随着基因工程技术和代谢控制理论的发展，定向育种发挥着越来越大的作用，但传统的诱变技术仍然是大多数工业微生物育种的重要技术【2】。传统诱变技术包括应用各种物理化学方法，例如紫外诱变，X射线，NTG诱变，由于其低廉的成本及简单的使用方法，仍然是目前大多数菌体选育首选且使用最多的方法，现有用来进行诱变育种的出发菌株应对诱变剂敏感，变异幅度大，经诱变处理过的高产菌株，并一定是继续提高产量潜力大的菌株。这是因为，诱变获得的高产菌株再诱变时易出现负突变，继续提高产量较为困难【3】。本实验利用紫外线进行诱变，得到D1/D2=6：1的诱变菌株，相较于未诱变前D1/D2=8：3酶活力显著提高为原来的2.25倍，可用于进一步的发酵复筛。 材料与方法 1.1材料 1.1.1原料 初筛并保藏的菌种 1.1.2 培养基 1）LB发酵液体培养基 ： 蛋白胨：10.0g；酵母膏：5.0 g；氯化钠：10.0g；蒸馏水：1000mlpH到 7.0。 2）初步筛选固体培养基 ： 脱脂奶粉：5.0g；酵母膏：2.0 g；琼脂：20.0g；蒸馏水：1000mlpH: 7.0。 3）LB斜面保藏固体培养基： 蛋白胨：10.0g；酵母膏：5.0 g；氯化钠：10.0g；琼脂：20.0g；蒸馏水：1000ml；pH到 7.0。 1.1.3 实验仪器：接种环，摇床，1000uL移液枪，离心机，离心管，振荡器，酒精灯，擦手酒精棉，无菌空培养皿，超净工作台，秒表，磁力转子，涂布器，直尺，报纸，比色卡 1.1.4 试剂：生理盐水， 1mol/L NaOH溶液 1.2方法 1.2.1菌种活化 接种环挑取斜面保藏培养基中的菌种，置于LB活化培养基中37。C摇床培养12h。 1.2.2离心 1.2.2.2微量移液器移取9ml活化菌液于10ml离心管中，振荡，两组平行，3000r/min 10m离心10min。 1.2.2.2 移去离心管中的上清液，加入4ml生理盐水，振荡器振荡至菌体溶于其中，两组平行，3000r/min离心10min。 1.2.3紫外线照射 1.2.3.1将离心所得样品移去上清液，加入4ml生理盐水，振荡器振荡至菌体溶解，将两组混在一起. 1.2.3.2移取3ml菌液加入空培养皿中，加入一个洁净的磁转子，两组平行，编号为1、2，剩余2ml加入留作对照。 1.2.3.3将1、2两个3ml菌液培养皿移去皿盖，暗室中在15W紫外灯下分别照射1min、3min，距离30cm。对照组不做照射。 1.2.4培养皿培养 分别从1、2号培养皿中移取1ml菌液，梯度稀释至10-6，取10-3~10-6各100ul涂布于固体牛奶培养基中，用报纸将其完全包装，黑暗环境中37。C培养24h。（此步操作于黑暗环境中红光灯下进行） 2结果与分析 2.2分析 对照组未经紫外线照射，其余条件均与试验组条件相同。在其结果中，-3培养基中有较多菌落，-5水平培养基中仅有一株菌落，-4，-6水平均无菌落。经分析讨论认为，出现此种情况的原因是实验过程中出现过大的失误，导致实验结果与预期结果出现较大偏差。实验组中，1组经紫外照射1min，2组经三分钟紫外照射，实验结果：1组中，-3、-4、-5水平均出现突变菌株，-6水平未出现菌落，推测其可能原因是菌体浓度过小，也存在偶然因素。2组中均未长出菌株，最可能原因是照射时间过长。再有突变生长的1组中，-3、-5水平中的菌落直径较小，但其透明水解圈较大，均达到D1/D2=6:1，-4水平培养基中菌落较大，但其透明水解圈的直径相对较小，本组选取-3水平培养基中的菌株YB1，进行LB斜面培养基进行保藏，用以进行复筛。 参考文献： 【1】贾英民 马宏颖 中性蛋白酶高产菌株的诱变及发酵条件 河北农业大学 2008 【2】朱