学生用-发酵法生产乳酸讲义1.docVIP

发酵法生产乳酸及发酵液中残糖的测定 一、实训原理 米根霉可利用糖或利用淀粉或淀粉质原料生成L-乳酸。米根霉作为好氧真菌，是依靠呼吸产能并提供合成菌体的中间产物，就发酵产物而言，其发酵类型属混合酸发酵，它经由EMP途径生成丙酮酸，然后进人三梭酸循环，米根霉能将大部分糖转化为乳酸，但同时也有乙醇、富马酸、琥珀酸、苹果酸等其他产物。 菌体生长过程中发酵液中残糖的测定可以采用费林热滴定法测定。 二、试剂的配制 1.菌种：米根霉 2.斜面培养基 PDA培养基：去皮马铃薯200g，切成小块，加1L水，煮沸30min,用双层纱布过滤取清液，加水补充因蒸发而减少的水分，加入20g的葡萄糖，琼脂15~20g。 3.基础种子培养基 葡萄糖3%，NaNO30.2%，K2HPO40.1%，FeSO40.001%，KCl0.05%，MgSO4·7H2O0.05%,pH6.6 4.基础发酵培养基 同基础种子培养基 5.费林试剂 甲液：称取15g硫酸铜（CuSO4·5H2O）及0.05g亚甲基蓝，溶于蒸馏水中并稀释到1000mL。 乙液：称取50g酒石酸钾钠及75g NaOH，溶于蒸馏水中，再加入4g亚铁氰化钾［K4Fe（CN）6］，完全溶解后，用蒸馏水稀释到1000mL，贮存于具橡皮塞玻璃瓶中。 0.1％葡萄糖标准溶液 准确称取1.000g经98～100℃干燥至恒重的无水葡萄糖，加蒸馏水溶解后移入 1000mL容量瓶中，加入5mL浓HCl（防止微生物生长），用蒸馏水稀释到1000mL。准确吸取费林试剂甲液和乙液各5.00mL，置于250mL锥形瓶中，加蒸馏水10mL。从滴定管滴加约9mL葡萄糖标准溶液，加热使其在2min内沸腾，准确沸腾30s，趁热以每2s 1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点。记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积。平行操作3次，取其平均值，按下式计算：式中：──10mL费林试剂（甲液和乙液各5.00mL）相当于葡萄糖的量，mg； C──葡萄糖标准溶液的浓度，mg/mL； V──标定时消耗葡萄糖标准溶液的总体积，mL。 样品溶液预测定 吸取费林试剂甲液及乙液各5.00mL，置于250mL锥形瓶中，加蒸馏水10mL，加热使其在2min内沸腾，准确沸腾30s，趁热以先快后慢的速度从滴定管中滴加样品溶液，滴定时要保持溶液呈沸腾状态。待溶液由蓝色变浅时，以每2s 1滴的速度滴定，直至溶液的蓝色刚好褪去为终点。记录样品溶液消耗的体积。 样品溶液测定 吸取费林试剂甲液及乙液各5.00mL，置于锥形瓶中，加蒸馏水10mL，加玻璃珠3粒，从滴定管中加入比与测试样品溶液消耗的总体积少 1mL的样品溶液，加热使其在2min内沸腾，准确沸腾30s，趁热以每2s 1滴的速度继续滴加样液，直至蓝色刚好褪去为终点。记录消耗样品溶液的总体积。平行操作3次，取其平均值。 式中：X—样品中还原糖的含量（mg） ——样品的原体积（ml） ——测定时消耗样品溶液的体积（ml） M——10ml甲、乙液相当于葡萄糖的质量（mg） 四、注意事项 （1）费林试剂甲液和乙液应分别贮存，用时才混合，否则酒石酸钾钠铜络合物长期在碱性条件下会慢慢分解析出氧化亚铜沉淀，使试剂有效浓度降低。 （2）滴定必须是在沸腾条件下进行，其原因一是加快还原糖与Cu2＋的反应速度；二是亚甲基蓝的变色反应是可逆的，还原型的亚甲基蓝遇空气中的氧时会再被氧化为氧化型。此外，氧化亚铜也极不稳定，易被空气中的氧所氧化。保持反应液沸腾可防止空气进入，避免亚甲基蓝和氧化亚铜被氧化而增加消耗量。 （3）滴定时不能随意摇动锥形瓶，更不能把锥形瓶从热源上取下来滴定，以防止空气进入反应溶液中。