应用直接测序法对食管癌组织中MT-2A基因突变状况的探究.pdfVIP

tP文摘要 。羔^j羔薮尻j莩法列会营癌冀篆：；： M”■2A基因突变状况的研究 摘 要 目的：河北省中离音E食管癌的发病率居世界之首，(：专管癌×于放疗和 化疗均不敏感，因此目前的治疗措施以手术为主：困此，；通过备静基础研 究，探索食管癌的病匿和发痫机常I，有助于食营凄的?发现、早谚焉一早 治疗，同时在评估食管癌患者的预后方面，都j汀蔷移灏§0意义二、I了巴绽 这一高表达j曼可能与基因突变有关，本研究选取妥篙：，垃思考，手_强蔓傅萁 聚合酶链式反应i chain Polymerase 因的相关基因宁列。通过直接测序法得到扩增基z：-ELo：TF≯歹6，而后j爵J}!彳f一；耋j；果 进行分析，并同人类基因组计划基因比对，寻找有无目的基因突≥-p=-Ii-_存在， 以研究MT蛋白编码区是否存在能够导致编码蛋白改变的基因突变： l 方法：1新鲜食管癌组织和正常食管粘膜组织的获得?收兵20O年5 月．2011年1 2月在河北医科大学第四医院胸外科手术的36例食蕾j毒患-吲V‘约 7．71 食管癌标本和癌旁正常组织。其中男性24例，女性l2例．年龄范闭盔3 岁，平均年龄63岁。手术获得新鲜食管癌组织，选取距癌缘5cm以一l的食 管“正常”粘膜组织作为正常对照。采集组织过程在低温环境下逆行，采集 后标号并投入液氮保存备用。待术后病理证实为食管鳞状细胞癌的标本入 组研究。 2将所采集组织切割大小约0．5x0．5x0．5mm自,j组织制作蜡块。将蜡块 切片后行娅染色，确定采集标本为所取组织。 3组织DNA提取。切割部分标本行脏染色后，剩余标本采用饱和 获得其浓度及纯度．20℃保存备用。 上海生工代为设计引物，经Blast确定引物特异性符合实验要求后台成引 三i矗j：警西叠珏广增。傲据：；0巩i’议曩÷茜革疆≥逆二j：盛支i?㈠_三。j 2．3℃进行预实验摸索最佳退火温受。根据颈实验所得条件进行目的基雹 的PCR扩增，经琼目旨糖凝胶电泳确认扩增效果并判断基因突变可能。 6目的基因的直接测序和结果分析。PcR-J：7．。增后得到目的基禹经琼 g旨：黪凝胶宅泳确认后送生工生物工程(上海)有限公司，委托其对扩增t 物进行芷反链同时测序，在两个J：i-；．74完全吻合情况下，能够确f宋1007，乞可 靠。最终得到扩增片段的具体序列。而后将昕得结粜进行分析，并嗣人类 基因组÷t-X0基因比对，寻找有无目的基因突变，!董存在。 结果：l所有临床采集标本经HE染色确沙、，氢管癌组织：匈为食曹瞵 癌组织，“正常”食管粘膜组织均不禽食耸2-z：簿组织成分一 的条带，条带单一清晰，位置一致，说明冬组织DNA中的引物设计区域 无突变存在，上下游引物区间未有j盖入或镀戋墓毪片段： 3经基因测序检测，全部食管壤组织和正常组织标本中均未发现 MT-2A的DNA外显子区域存在碱基点突变表现。 患者中，31例不存在该多态位点，5刚存在陔多态位点，』i在瘸组缪乖[j正 常组织中均存在该多态位点。比对人类基因组计划基因唪后，汪交该多态 位点存在。同NCBI数据对比，应用卡方j险验分析证实两者无差别 (P=0．098)。 结论：食管癌患者的食管癌组织中MT-2A的DNA序列呈现出高疫 保守的现象，即在食管癌组织中未发现能够导致MT-2A编码蛋白改变的 DNA突变存在。由此我们认为造成食管癌组织中MT-2A蛋白的蓄积的原 因可能是其降解下调造成的，其具体原因有待进一步实验解释。而外显子 有影响，以及其与患者预后之间有无关联仍需进行深入研究。 关键词：食管癌；金属硫蛋白；直接测序法；基因突变：多态性 芝文拇要 。’ P， 峨 ●l ’ njoi：i