样品处理-扬州大学测试中心.PDFVIP

实用流式细胞技术及其样品处理 Practical flow cytometry and sample preparation 胡茂志 扬州大学测试中心 三、样品及其前处理 总的要求 颗粒：细胞 单细胞悬液，避免任何细胞沉积 荧光标记 仪器的限制：激光器、滤光片--荧光素 实验的限制：荧光素组合 1、细胞大小 Injector Tip 所有的细胞均需要经过过滤： 200 （75μm）-300 （45μm ）- 400 （37μm）目 喷嘴：70和100μm 2、细胞物理参数的变化  不同的处理和固定方法也可能造成FSC信号的改变。另外，非球形细胞 （禽类红细胞）由于其在液流中空间取向不同，也可能导致对同种细胞 的FSC信号完全不同。  在可能的情况下，尽量用荧光参数来设门。 3、设门  散射光设门：注意细胞  荧光设门：要明显区分 形态的变化 阴、阳性细胞 4、荧光补偿 FITC PE ECD PC5 PC7 APC y t i s n e t n I 500 600 700 800 Wavelength nm 需要用单标样品来调节荧光补偿 5、红细胞的影响  溶血：不影响表面抗原的标 记，常用标记后溶血 6、洗涤效果 7、标记效果 表面抗原（标记荧光和自发荧光） 改变抗体的量是改 变浓度而不是体积 less than or equal to 0.5μg per million cells in a 100μl total staining volume 胞内抗原（IC：同型对照） 避光标记  同一实验尽量用同厂家、同批次高质量抗体。 按照说明，标记试剂一般不能冻存 慎用未经FCM鉴定的抗体 首选直标，间标有时效果不好 8、实验对照的设计  空白对照  阴性对照：常用同型对照 单色分析：同型对照 多色分析：同型对照、单阳性对照 同型对照：与抗体相同种属来源、相同剂量和相同亚型的免疫球蛋白， 用于检测由于抗体非特异性结合而产生的背景染色。  阳性对照：检测阴性时  Fc受体的阻断：与抗体匹配的动物的血清或IgG 。 9、细胞数量  统计学意义 6  计数：10 数量级/0.1-0.5ml  非常规检测的样品，调节参数需要消耗一些细胞  需要分析的细胞至少要大于500个。  DNA分析的样品要大于10000个。 10、细胞成分的定量