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调控NPM 对人皮肤鳞癌细胞增殖活性的影响研究 中文摘要 调控NPM 对人皮肤鳞癌细胞增殖活性的影响研究 中文摘要 目的： 本研究观察使用小分子干扰RNA （siRNA）沉默NPM 基因表达对人皮肤鳞状细 胞癌A431 细胞状态及黄芩苷作用的影响，旨在明确NPM 在皮肤癌发生进程的作用 以及加深人们对皮肤肿瘤发生分子机制的理解。 方法： 1、细胞培养：人皮肤鳞状细胞癌A431 细胞用含10%胎牛血清（FBS ）的DMEM 高糖培养基培养于37℃、5%二氧化碳的培养箱中。 2 、药品配制：将1ML 二甲基亚砜（DMSO ）作为溶媒加入黄芩苷粉末中，配制 成40mg/ml 的储存液于棕色容器中，置入-20 ℃的冰箱中备用。本实验中，黄芩苷的 终浓度为50μg/ml。 3、siRNA 干扰：针对NPM mRNA 序列设计合成特异性siRNA，转染A431 细胞， 并在相应时间加入50μg/mL 黄芩苷孵育，采用实时定量PCR （Real-time PCR ）法检 测NPM 基因沉默效果。 4 、细胞增殖活性检测：以细胞增殖/毒性检测试剂盒 （cell counting kit-8，CCK8 ） 法检测A431 细胞增殖活性的变化。 5、细胞周期检测：流式细胞术检测A431 细胞周期的变化。 结果： 1.经过比较不同转染试剂与siRNA 的滴度，并通过观察FAM 绿色荧光，我们获 得了良好的转染效率；实时定量PCR 结果显示，各转染组细胞中的NPM mRNA 的 相对表达量均低于对照组，差异有统计学意义( P0.05)，表明NPM 表达受到明显抑 制。我们选取沉默效果最好的siRNA 片段进行后继实验。 2.与空白对照组比较，单独以NPM siRNA 转染细胞24h、48h、72h 后，细胞的 增殖速度明显降低；而在加入黄芩苷孵育后，A431 细胞的增殖活性显著降低，而随 I 中文摘要 调控NPM 对人皮肤鳞癌细胞增殖活性的影响研究 着时间延长，细胞的活性有所增高，但是仍然低于空白对照组；而当黄芩苷合并NPM siRNA 一起处理时，对A431 细胞的增殖活性抑制作用最显著，且随着时间的延长而 无增强，表明NPM 基因沉默后A431 细胞增殖活性显著降低，黄芩苷孵育亦可抑制 细胞增殖活性，而NPM 基因沉默可明显增强黄芩苷的作用； 3.与对照组相比，siRNA 沉默NPM 后，A431 细胞S 期细胞百分率增加，而G2/M 期细胞百分率减少；当单纯加入黄芩苷孵育后，S 期细胞百分率增加；且黄芩苷合并 NPM siRNA 一起处理时，S 期细胞百分率进一步增加，而G2/M 期细胞百分率下降， 这表明A431 细胞在上述各种条件下均发生S 期阻滞，使细胞分裂生长活性受到抑制。 结论： 通过siRNA 沉默NPM 基因的表达可明显降低人皮肤鳞状细胞癌A431 细胞的增 殖活性，并引起细胞周期阻滞，表明细胞的生长受到显著抑制。这提示NPM 基因可 能在皮肤肿瘤的发生过程中具有调控作用，并可能作为皮肤肿瘤基因治疗的潜在靶 点。而黄芩苷对人皮肤鳞癌细胞有一定的抑制增殖作用，NPM 可能是其抗癌活性的 重要靶点，但具体机制尚待进一步研究。 关键词：NPM ；黄芩苷；皮肤鳞癌；细胞周期；细胞增殖 作 者：余秀琴 指导老师：钱齐宏 闵 玮 II 调控NPM 对人皮肤鳞癌细胞增殖活性的影响研究