调控胃癌BGC823细胞PTEN及Livin基因表达的生物学效应实验研究.pdf

中文摘要 生物学效应实验研究 博士研究生 赵春临 导 师 王家祥 郑州大学第一附属医院外科 中文摘要 背景与目的 胃癌的发病率在恶性肿瘤中位居第四位，仅次于肺癌、乳腺癌和肠癌，是 严重威胁我国人民生命健康的主要疾病之一，其发病机制迄今为止仍不明确。 胃癌在发病早期症状不典型，部分患者就诊时已进入进展期。尽管在手术、化 疗、放疗等方面取得了长足进步，但是进展期胃癌患者术后5年生存率仍无明显 提高。 大量研究表明，胃癌在发生、发展过程中有多种因素的参与，包括抑癌基因 失活、癌基因突变、DNA损伤修复功能的降低、信号转导通路和凋亡过程的异 常等，提示胃癌的发生、发展是一个多因素、多阶段、多步骤的过程。 andtensin 第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因(phosphatase deletedonchromosome homology ten,PTEN)是具有双特异性磷酸酶活性的抑癌 基因，可以负调节P13K．Akt信号通路的信号转导，具有抑制细胞增殖和迁移以及 促进凋亡的效应。PTEN基因的突变、缺失以及甲基化可以导致其抑癌功能丧失， 引起肿瘤的发生。研究显示，胃癌组织中PTEN基因表达显著降低，并且PTEN 蛋白表达水平与肿瘤大小、Borrmann分型、淋巴结转移和肿瘤分期呈负相关， 表明PTEN基因失活可能是胃癌发生、发展的原因之一。 Livin是凋亡抑制蛋白(inhibitorofapoptosisproteins，IAP)家族新成员之一， 它可以和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)直接结合而抑制细胞凋亡， 进而起到促进肿瘤细胞生长的作用。研究发现Livin蛋白在包括胃癌在内的多种 中文摘要 肿瘤组织中呈现高表达，沉默肿瘤细胞中Livin基因可以促进细胞凋亡、抑制肿 瘤增殖。表明Livin的高表达与肿瘤的发生、发展及预后相关。 本课题采用分子生物学技术，分别建立过表达PTEN基因、沉默Livin基因 表达以及过表达PTEN同时沉默Livin基因表达的胃癌细胞株；通过在体和离体 实验，观察调控PTEN和Livin基因表达对胃癌细胞生长、增殖、凋亡和迁移等 方面的影响，为胃癌的治疗提供新的靶点和策略。课题共分三部分：第一部分， 控PTEN、Livin基因表达对胃癌BGC823细胞生物学行为的影响；第三部分， 调控PTEN／Livill基因表达对裸鼠移植瘤生长的影响。 方法 个针对Livin基因的siRNA靶序列，合成发卡样DNA单链；退火成双链后与 定插入序列，得到3个针对Livin基因的siRNA载体。分别用脂质体 和PTEN mRNA和蛋白表达水平。 挂电 二日木 cDNA ORF区段目的基因；转化后得到多个 1．PCR扩增得到1212bp的PTEN 重组子，经EcoRI／SalI双酶切和DNA测序鉴定证实获得的重组子 pCL-neo．PTEN正确。 2．RNAi Center扫描人LivincDNA编码序列 Explorer和siDESIGN (NM139317)，初步筛选得到50个侯选片段，经BLAST同源性分析，选择确定 II 中文摘要 (GGAAGAGACT丌GTCCACA)。 3．双链发卡样DNA 重组子，PCR扩增筛选鉴定和DNA测序分析证实得到的阳性重组子 1组(转染 4．过表达PTEN组(转染pCL．neo．PT