转染靶向SAA基因siRNA对高糖诱导人肾小球系膜细胞分泌FN和TNF-α的影响.pdfVIP

·中文论著摘要· 泌FN及TNF-(I的影响 目 的 糖尿病肾病(diabeticdesease，DKD)是糖尿病(diabeticmellitus，DM)I拘常 kidney 见微血管并发症，是终未期肾功能衰竭的主要原因之一。DKD的发病机制目前尚 未完全明了。DKD病理表现早期主要表现为。肾小球系膜细胞肥大、增生、细胞外 基质(extro．cellular 重要组成成分。晚期主要表现。肾小球硬化、纤维化以及。肾小管闻质纤维化。肾小 球系膜细胞肥大、增生在ECM的集聚和后期的肾小球硬化中起主导作用。高糖可 诱导人肾小球系膜细胞(human cells，HMCs)的肥大、增生、ECM集聚， mesangial 乃至纤维化。高糖也可诱导肾脏的炎症反应进而加重DKD。 血清淀粉样蛋白A(serum A，SAA)是一种敏感的急性时相蛋白。近年 amyloid 反应的关系尚有许多未知。本实验研究SAA．siRNA干扰对高糖条件培养下的 HMCs炎症反应及ECM的影响，探讨SAA在DKD发生发展中的作用。 实验方法 一、细胞培养和计数 将冻存的HMCs株投入37。C温水中，摇动使尽快解冻。吸出细胞悬液并加入 弃上清用MCM．4201培养基稀释混匀，接种于培养瓶中，37。C 5％C02孵箱中孵 育，细胞贴壁后隔同换液，3—5天长满并融合成单层，用0．25％胰蛋白酶消化，传 代比例为1：2，取对数生长期细胞，计数细胞后调整细胞数接种于6孔培养板中待 细胞均匀铺满容器底面70．80％后，分组实验。 二、实验分组 1 将上述培养细胞更换Opti．MEM培养基中培养24小时，使细胞同步化，然后 5％C02孵箱中孵育48h。分别 (6)高糖+SAA．siRNA组(HG+SAA．siRNA)。37(2 于0h，12h，24h，48h收集上清，48h收集细胞进行实验。 三、siRNA合成与转染 根据GenBank数据库提供的人SAA全长基因，脂质体瞬时转染方法转染细 fluorescent 胞，以绿色荧光蛋白(Green 染48h后在荧光倒置显微镜下观察GFP的表达，计算转染效率。 四、real-time PCR检测mRNA表达 RNA 逆转录为eDNA，取cDNA 30s，72℃延伸30s同时获取荧光，共40个循环，后行产物的溶解曲线分析，得到 样品量的参数Ct值(循环阈值)。以2-AACt表示基因的相对表达量。 五、Elisa检测蛋白表达 从已平衡至室温的密封袋中取出所需板条，除外空白孔，分别将标本(标准 内液体，每孔加洗涤液350ul，静置30sec甩净，在厚叠吸水纸上拍干。加入生物 素化抗体工作液，封口膜封住反应孔37(2孵育30min，洗板，空白孔外加入酶结 育15min，加入终止液，测OD450值。 六、统计学处理 所有数据以X±S表示，采用SPSS17．0统计分析软件，组间比较采用单因素 2 结 果 一、siRNA转染率 效率达80％。 二、real-time PCR检测mRNA表达结果 差异有统计学意义(P0．05) 三、Elisa检测蛋白表达结果 明显增高，差异均有统计学意义(P0．05)。各个时问点与NG组相比，各蛋白的 有明显下降，差异有统计学意义(尸锄．01) 结论 FN，TNF．a的分泌，减少。肾小球ECM的积聚及肾小球炎症反应，为DKD的防治 提供了新的靶点。