大学生实验创新计划项目报告书书.doc

大学生实验创新计划项目 结题报告书 项目名称：七彩山鸡源大肠杆菌产ESBLs的检测及药敏分析 施冲旭 所在学院： 牧医工程学院 专业年级： 08级动物医学 指导教师: 潘玉善 职称 讲师 起止年月： 2009 年 10 月至 2010 年 3 月 填写日期：2010 年4 月 14 日 七彩山鸡源大肠杆菌产ESBLs的检测及药敏分析 ? 施冲旭、杜艳丽、冯芬芬、黄旭东、翟明胜 指导老师：潘玉善 摘要：采用全自动微生物鉴定系统（Vitek-32）鉴定了8株七彩山鸡源大肠杆菌，并对分离菌进行超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的检测，及对14种抗菌药和2种复方药物进行敏感性测定。结果显示，分离的8株菌大肠杆菌均不产ESBLs，对药敏试验结果表明该分离的大肠杆菌对兽医临床中常用的3大类抗菌药（氟喹诺酮类、氨基糖苷类、磺胺类）9种药物均产生高度耐药，显示出严重的多重耐药性。 关键词：七彩山鸡；大肠杆菌；超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）；药敏分析 七彩山鸡是珍禽品种中养殖比较简单、抗病力强、市场销路大，已在我国南北各地得到普及发展的优良珍禽品种。但近年来，随着养殖规模和养殖区域的扩大，一些常见条件性致病菌如大肠杆菌，也像肉鸡场、蛋鸡场那样常发，给养殖户带来很大的损失。目前，鸡大肠杆菌病的治疗主要依靠抗菌药，但随着抗菌药的广泛、大量甚至不规范使用，细菌耐药性的产生越来越严重，给临床预防和控制该病造成很大困难。七彩山鸡根据其发病情况、临床症状、剖检变化及Vitek-32全自动微生物鉴定仪鉴定，确诊为大肠杆菌感染。为探明该鸡场药物防治失败的原因，本试验对临床分离的8株鸡大肠杆菌进行了ESBLs检测，并用标准K-B纸片法测定了8株菌对14种抗菌药物及2种复方药物的敏感性，以便为掌握鸡大肠杆菌产ESBLs情况以及临床合理选择抗菌药提供科学理论依据。 1 材料和方法1.1材料 1.1.1菌株来源 8株试验菌源于2009年7月自荥阳某珍禽有限公司送检患病死亡的七彩山鸡肝脏和心脏分离，并经Vitek-32全自动细菌鉴定仪鉴定的大肠杆菌。质控菌株：大肠埃希氏菌ATCC25922（由中国普通微生物菌种保存中心提供），肺炎克雷伯菌ATCC700603 （由北京大学医学部提供）。 1.1.2药敏纸片 药敏纸片：头孢他啶CAZ、头孢噻肟CTX、氨曲南AZT均为30 μg/片，头孢他啶/棒酸CAZ/CA、头孢噻肟/棒酸CTX/CA均为30 /10 μg/片；阿米卡星（AN）、氨苄西林(AM)、环丙沙星(CIP)、庆大霉素(GM)、链霉素(S)、妥布霉素(TM)、新霉素(N)、米诺环素(MNO)、多西环素(DO)、氨苄西林/舒巴坦(AM/SU)、左氧氟沙星(LVF)、诺氟沙星(NOR)、磷霉素(FOS)、磺胺甲恶唑/甲氧苄啶(SXT)，以上药物均为北京天坛药物生物技术开发公司生产。 1.1.3培养基 麦康凯琼脂、琼脂、胰蛋白胨大豆肉汤SS琼脂购自杭州天和微生物试剂有限公司。 1.1.4仪器 VITEK-32全自动微生物鉴定系统和GNI革兰氏阴性菌鉴定卡：法国生物梅里埃公司产品；超净工作台（苏净集团安泰公司制造），隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）等。 1.2方法 1.2.1细菌的分离、鉴定 无菌从病死鸡中挑取少许心、肝组织接种于TSB增菌液中增菌培养18 h，再次划线接种于麦康凯琼脂平板上和SS琼脂平板上，37恒温培养18 h后挑取在麦康凯琼脂平板和SS琼脂平板上单个典型菌落进行纯培养。经涂片、染色、镜检，证实为纯培养物，将其作为试验受试菌株。Vitek-32全自动微生物鉴定系统进行鉴定。 1.2.2 ESBLs的检测 按美国临床实验室标准化协会（CLSI）推荐的表型确证试验法进行：将浓度为0.5个麦氏单位的受试菌液用无菌棉签涂布于MH平板，分别两两对应贴上头孢他啶（CAZ，30　μg/片），头孢他啶/棒酸（CAZ/CA，30　μg/10　μg/片），头孢噻肟（CTX，30 μg/片），头孢噻肟/棒酸（CTX/CA，30　μg/10　μg/片）纸片，37培养16 h，测量抑菌圈大小。当两组药物中有任意一组中有加CA的抑菌圈直径比不加CA的抑菌圈直径相差≥5 mm，即确定为产ESBLs菌株。 1.2.3药物敏感性试验