肺炎链球菌中HtrA和PpmA的结构的分析研究.pdfVIP

摘 要  摘 要 1． 肺炎链球菌中温度依赖的蛋白 HtrA 的结构研究  HtrA  (high­temperature requirement A)  是一种温度依赖的热休克蛋白，它 通过感应外界温度的变化来调节两种功能的转化，分别是：正常温度时行使分 子伴侣功能，以及温度升高时的丝氨酸蛋白酶活性。这种功能上的精确转化使 得  HtrA 在维持蛋白质的稳定性以及降解热变形的蛋白以维持细胞的稳定性过 程中起关键作用。它被认为是细菌周质间隙中蛋白质质量调控体系中的关键蛋 白。研究证实 HtrA 对于帮助细菌和细胞抵抗高温损伤都有重要作用。HtrA 家 族蛋白广泛分布在从古细菌到人类的许多的组织中。近期的生物化学和结构学 研究证实，不管是细菌抵抗一系列的环境压力还是蛋白质质量调控，都是通过  HtrA家族蛋白的结构和功能的精确变化来完成的。然而，其精确的蛋白质质量 调控方式还有待研究。为了更好的解析 HtrA家族蛋白的作用作用方式，需要进 一步对其进行生物化学和结构学研究，帮助我们对其分子功能以及其特殊的分 子调控机制有更好的理解。我们已经得到了肺炎链球菌的基因组 DNA，经过 PC R 扩增出一个 htrA 全长基因和丝氨酸蛋白酶功能域片段，随后分别插入 p28 质 粒进行表达载体的构建。其中全长蛋白经过表达优化与纯化后，可以得到大量 的可溶状态。蛋白质初筛后得到晶体，目前我们尝试优化了各种条件，但是没 有优化到合适于 X 射线衍射的蛋白晶体。 2． 肺炎链球菌中假定的蛋白酶成熟蛋白 PpmA 的结构研究 在过去的 20 年中，肽基脯氨酰顺反异构酶积累了大量的研究数据，分别在 生理，细胞生化，分子动力学以及蛋白质结构研究中取得了相当多的进展。尽 管肽基脯氨酰顺反异构酶催化的顺反异构作用本身并不复杂，但是但目前为止 对于详细的蛋白催化机理仍没有得到完全的解释。我们研究的 PpmA (Potential  proteinase maturation protein A)  属于被广泛研究的肽基脯氨酰顺反异构酶的小 细胞蛋白家族。我们已经得到了肺炎链球菌的基因组 DNA，进行 PCR 扩增出一 个 ppmA 全长基因和一个功能域片段，随后分别插入 p28 质粒进行表达载体的构 建。其中 PpmA 全长蛋白经过表达优化与纯化后，可以得到大量的可溶状态，但 是晶体筛选后没有得到蛋白晶体。 关键词： 温度依赖 丝氨酸蛋白酶 肽基脯氨酰顺反异构酶 晶体结构 I  Abstract  ABSTRACT  1. The structural study on High­temperature requirement proteinA  from Streptococcus pneumoniae  The HtrA (high­temperature requirement A) protein is a heat shock protein and  functions in a temperature­dependent manner as a molecular chaperone at normal  temperature or as a serine protease at elevated temperature. This functional switch of  HtrA plays an important role in controlling protein stability as well as degrading  heat­denatured proteins to maintain cellular viability. HtrA is known as a key player  in the protein quality control system in the bacterial periplasmic space. It was found  that HtrA is essential for bacteria and cell survi