α-淀粉酶酶活力测定实验(碘比色法).pptVIP

α-淀粉酶酶活力测定实验——目视碘比色法 酶活力单位测定的介绍 测定的目的——纯化不容易；纯化过程中容易失活——质量（重量）不能用于定量； 酶活力和酶活性的差别 酶活力反应的实质——催化反应速度高低 酶活力单位的定义及表示——增加可比性 国际标准（25℃、1min、1umol） 实际应用的标准 酶活力的测定方法 单位时间内底物的减少量或产物的增加量 反应完一定量底物的时间长短 测定物的要求：可测性、反应的专一性、稳定性、简便性 比酶活力的定义——1mg酶蛋白的酶活力（有时用1g表示） 测定过程中的条件控制——温度、pH等 酶活力测定的方法 碘比色法（有相应的国家标准） 在一定反应条件下，1小时转化1g淀粉变为糊精的酶量定义为1个酶活力单位 3，5-二硝基水杨酸比色法（DNS法） 在一定反应条件下，1分钟反应生成1mg麦芽糖的酶量定义为1个酶活力单位 注意：去除β-淀粉酶的干扰 医学上的一些测定方法（专用试剂盒，通过生化仪器反应测定，需要微量快速） 1、了解α-淀粉酶酶活力测定的原理及设置标准 2、掌握熟悉α-淀粉酶酶活力测定的方法步骤（目视碘比色法） 目的要求 酶测定中的一些问题 1、你怎样解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？ 2、解释在细菌培养中吲哚检测的化学原理，为什么在这个试验中用吲哚的存在作为色氨酸酶活性的指示剂，而不用丙酮酸？ 测定方法要求：可比、实用简便、干扰小。 酶活力的测定方法（两类）： 单位时间内底物的减少量或产物的增加量 反应完一定量底物的时间长短 淀粉酶的基本情况介绍——四大类 酶名 α-淀粉酶 β-淀粉酶 糖化淀粉酶 异淀粉酶 别名 淀粉-1，4-糊精苷酶、液化酶 淀粉-1，4-麦芽糖苷酶 淀粉-1，4-葡萄糖苷酶、糖化酶 淀粉α-1，6-葡萄糖苷酶、支链淀粉酶 作用键类型 α-1，4 α-1，4 α-1，4 α-1，6 作用键位置 键内键端 非还原端 非还原端 非还原端 水解键长度 2或6糖单位 2糖单位 1糖单位 分枝点 跨越分支 跨越 不能跨越 跨越 可切断分支 产物 麦芽糖、糊精 麦芽糖、极限糊精 葡萄糖 糊精 水解限度 30%-90% 80%-100% 主要产生菌 枯草芽孢杆菌 黑曲霉 米曲霉 细菌 根霉 红曲霉 黑曲霉 产气气杆菌 产色链霉菌 酵母 酶促催化反应分解淀粉等底物（反应物） 产物为麦芽糖、糊精等 反应式：淀粉→红色糊精 淀粉及糊精检测原理：碘检测 淀粉（紫蓝色，30分子以上）→红色糊精（红棕色，7-30分子）→无色糊精，7分子以下）→麦芽糖（不显色）→葡萄糖（不显色） 测定酶促反应分解一定量淀粉（给定）的时间，以红色糊精和碘反应的颜色作为终点指示（所给定淀粉都已转化为糊精的时间）。 根据反应所需时间和此方法的酶活力定义（相关公式推导），代入公式计算出酶活力单位。 α-淀粉酶酶活力测定的原理 酶活力测定的定义（碘比色法——目视） 酶活力定义：在60℃下1小时内将1克淀粉转化为糊精的酶量称一个酶活力单位（5~10分钟反应完成）。 计算公式： ｔ——为反应达到终点需要的时间（分钟），要求反应时间在5~10内完成 Ｎ——为酶的稀释倍数（控制反应时间） 酶活力测定步骤 发酵液（酶液） 2%淀粉液20mL+5mLpH6.0缓冲液 预热5min（60℃） 预热5min（60℃） 吸取0.5mL 混匀、计时（保温60℃），反应开始 在白瓷板上定时取样（1滴）比色 比色终点，计下反应时间（与标准比色管颜色相同） 代入公式计算酶活力单位 1mL标准糊精液＋3mL标准稀碘液 混匀 标准比色管（红棕色） 对照比色 确定反应终点 注意：发酵液或酶液可能需要稀释，使加入的酶量可以在规定时间内完成反应。 α-淀粉酶测定反应比色稀碘液检测显色变化过程 反应终点颜色 报告测定结果？ 目视碘比色法在测定α-淀粉酶酶活力时需要注意哪些问题？ 通过查阅资料，还有哪些关于α-淀粉酶酶活力测定的方法？说明其基本原理及主要适用范围？ 思考题 相关碘液的配制 碘原液：称取碘11g，碘化钾22g，置于小烧杯中，加10ml蒸馏水使之溶解，然后转入容量瓶中。再加少量的蒸馏水洗涤烧杯数次，洗涤液均转入容量瓶中，最后定容至500ml。摇均后放于棕色瓶中备用。 比色稀碘液：取碘原液2ml，加碘化钾20g，再用蒸馏水定容至500ml。摇均后放于棕色瓶中备用（时间不易太长？）。 标准比色碘液：取碘原液15毫升，加碘化钾8克，用蒸馏水定容至500毫升。储藏于棕色瓶内。 pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液： 2%可溶淀粉溶液及标准糊精溶液配制 2%可溶淀粉溶液：称取20g可溶淀粉，放入小烧杯中，加少量蒸馏水做成悬浮液。然后在搅拌下注入沸腾的700mL