聚合酶链反应技术(P的CR).pptVIP

聚合酶链反应技术（PCR）;PCR具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍, 肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。;Mullis 1993年度诺贝尔化学奖。 PCR技术是一种利用DNA变性和复性原理在体外进行特定的DNA片段高效扩增的技术，可检出微量靶序列（1个copy）。在模板DNA、引物和dNTP存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。 仅需用极少量模板，在一对引物介导下，在数小时内可扩增至100-200万copy.; PCR(Polymerase Chain Reaction) Three steps: denaturation, primer annealing, polymerization. PCR反应分三步：变性、退火及延伸。 ;PCR技术的基本原理　其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火：模板DNA变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补链，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4min，2～3h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。;标准的PCR反应体系： 　　　10×Buffer 　 ? 10ul　　　dNTP mixture 　 per 200umol/L　　　primers 　　　　 per 10～100pmol　　　　templete DNA 　　 0.1～2ug　　 　 DNA polymerase 　 2.5ul　　　　Mg2+　　　　　　 ? 1.5mmol/L　　　dH2O 　 ? 100ul;PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA???补的程度 ;;温度（℃）;PCR 应用;传染性疾病;法医学;植物遗传育种;畜 牧;植物保护;其他 ①考古学 ②植物分类学 ③群体生态学 ;实时定量PCR;定量PCR是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR技术是一种在PCR反应体系中加入荧光基团利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对DNA模板的定量而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点 。;作用原理;TaqMan探针方法的作用原理:; 在PCR的退火期，探针与引物所包含序列内的DNA模板发生特异性杂交。延伸期引物在Taq酶作用下沿DNA模板延伸，当到达探针处，Taq酶发挥5‘→3’外切核酸酶活性，继而发生置换，切断探针后，发射基团远离猝灭基团，荧光信号得到释放。 这时荧光探测系统便会检测到光密度增加。模板每复制一次，就有一个探针被切断，伴有一个荧光信号的释放。 ;;实时PCR技术原理;探针设计一般应符合以下条件：?;(2)?SYBR?Green?I荧光染料的原理;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.