5,6透射电镜样品制备-生物技术.ppt

透射电镜生物样品制备技术 把需要观察的生物材料制成适合电镜观察的特殊样品，这一系列的样品制作过程叫做样品制备技术。 这是电镜研究工作成败的三大关键问题（电镜操作、样品制备、图像观察分析）之一。 基本要求： 操作的基本环节： 1．取材 [2]方法： （2）体外培养细胞的取材： 2.固定：用化学固定剂迅速杀死细胞的过程。 【2】常用固定剂的特点 （2）锇酸（又称四氧化锇。OSO4, ） （3）其它固定液： 【3】戊二醛、锇酸双固定操作程序： 3、水洗与脱水： 4．浸透与包埋： 是将组织块制成能进行超薄切片的硬块。 （2）包埋液的组成： （3）浸透、包埋具体步骤： （4）包埋操作中的注意事项： a. 器材和试剂均应注意防潮。（干燥器、烤箱） b. 配制包埋液时，防止气泡产生。 （边加边搅拌，加完继续搅拌30-40分钟，40℃温箱中排气泡） c. 皮肤勿接触。 d. 及时清洗容器。 5．超薄切片 2）支持膜 3)修整包埋块： 4)制作玻璃刀：制刀 安水槽 封固 半薄切片定位： （2）超薄切片： 6．超薄切片染色（正染） 6．超薄切片染色（正染） 重金属盐有铀盐（如醋酸双氧铀）和铅盐（枸椽酸铅）等。 核酸和结缔组织结合 膜系统、糖原、核糖体 多采用铀、铅双重染色。 有毒、避光保存。 避免生成沉淀，注意： 良好固定的形态学标准： 二、负染色技术（阴性反差染色） 良好负染剂的条件： 负染的优缺点： 八、电镜细胞化学技术（电镜组织化学） （一）一般原理 （二）制样的基本要求 （三）对照 九、免疫电子显微镜技术 原理：根据抗原抗体特异性结合形成免疫复合物沉淀， 利用电子显微镜鉴定抗原一抗体的结合反应。 具有较高的特异性 可以对细胞表面或细胞内部的抗原进行定位、定性； 可以了解抗原一抗体复合物的结构细节及鉴定由免疫损伤引起的细胞病理变化等。 非标记直接观察法 （一）免疫铁蛋白技术 抗体 + 铁蛋白 免疫铁蛋白 + 抗原 抗原抗体复合物 偶联剂常用戊二醛 注意： （1）维持组织与细胞的超微结构。 （2）保护组织与细胞的抗原性。 （3）增强细胞对标记抗体的通透性。 铁蛋白电子致密，观察时反差大。 但铁蛋白分子量大（460 000），穿透能力差，所以适于细胞表面抗原的定位。 （二）免疫胶体金技术 抗体 + 胶体金 胶体金标记抗体 + 抗原 抗原抗体复合物 透射电镜及扫描电镜对细胞抗原、受体进行 定性、定位研究。 免疫胶体金 1. 较高的电子密度和高的电子散射能力； 2. 较高的熔点，在电子束照射下不升华； 3. 较高的溶解度，不易析出沉淀和结晶； 3. 在电镜下本身不呈现可见结构，分子细小，容易在不规则的样品表面渗透； 4. 与生物样品不发生化学反应等。 常用的负染色“染料”为磷钨酸和醋酸铀。 优点：反差强，分辨力高（可达15?左右） 快速、简单易行 染色本身不改变生物样品的活性， 不造成样品变形。 缺点：染色效果不很稳定， 有时在相同条件下染色的结果不一致。 研究的对象： 各种生化物质在细胞内的定位。 蛋白质（尤其是酶）、核酸、脂肪、糖、无机离子的定位。 电镜酶细胞化学技术： 在超微结构水平上研究各种酶的分布情况以及酶在细胞活动过程中的变化。 酶的定位： 酶与特异性底物作用，在反应部位形成可见的反应产物。 电镜要求形成电子致密的产物。 大多数酶的反应产物是可溶性的，用捕获剂，使可溶性的酶反应产物迅速转变成不溶性沉淀。 1．保存酶活性 影响酶活性低，甲醛和戊二醛前固定。 2．保存细胞超微结构 戊二醛保存结构好，但穿透速度与保存酶活性不如甲醛，而甲醛保存结构较差。常用0.5％～2%戊二醛和1％～4%多聚甲醛混合液做灌流固定。 3．定位保存 防止反应产物的扩散、移位。 4．使反应产物具有高度的特异性 切成40～50μm切片进行孵育反应。 5．反应产物可见化 如经捕获剂所得产物电子密度不高，则尚需用重金属处理，以形成高电子密度物质。 为证实酶学方法的特异性，在孵育液中加入适量的酶抑制剂或去底物等的实验方法，称对照。 假阳性和假阴性。 假阳性：一方面是由于某些底物出现自然水解和氧化，反应产物被吸附而出现沉淀；另一方面，非酶性