核酸的序列测定.pptVIP

（一） DNA变性 (denature) 1、DNA变性的概念 2、DNA变性的本质 3、导致DNA变性的因素 4、变性DNA的特征 5、DNA 的热变性 1、DNA变性的概念： 2、DNA变性的本质： DNA受到一些物理或化学因素影响后双螺旋间的氢键 断裂，双链解链，变成单链的无规则线团的过程。 维持双螺旋稳定性的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到 破坏，但不涉及到其一级结构的改变。 3、导致DNA变性的因素： 凡能破坏双螺旋稳定性的因素，均可引起核酸分子变性 如：加热、强酸、强碱、尿素、甲酰胺、盐酸胍等。 4、变性 DNA 的特征： （ 1 ）溶液粘度降低： DNA 双 螺旋是紧密的刚性结构，变性后 转化成柔软而松散的无规则单股 线团结构，因此粘度明显下降。 （ 2 ）旋光性发生变化：变性 后整个 DNA 分子的对称性及分 子构型改变，使 DNA 溶液的旋 光性发生变化。 （3）紫外吸收增强 ●增色效应 (hyperchromic effect) ：指 DNA 变性后其紫 外吸收明显增强的效应。 ●机理： DNA 分子中碱基上的共轭双键使 DNA 分子具有 吸收260 nm 紫外光的特性，在 DNA 双螺旋结构中碱基藏 入螺旋内侧，紫外吸收较弱。变性时 DNA 双螺旋解开， 于是碱基外露，更有利于紫外吸收，故而产生增色效应。 5、DNA 的热变性 （1）由于温度升高导致DNA 的变性称为热变性。 （2）DNA 的熔解温度 Tm ： 通常， DNA 的 Tm 值为：82～92 ℃ DNA 热变性时，其紫外吸收 的增加值达到总增加值一半时的 温度（或双链 DNA 解链一半时 的温度）称为 DNA 的熔解温度 （或变性温度）。 （3）影响 DNA 的 Tm 的因素： ●反之，异质DNA ，变 性发生在较宽的温度范 围内。 ① DNA 的均一性： ●均质DNA，变性发生 在很窄的温度范围内； ② G-C 含量：越高，Tm 越高 Tm = 69.3＋0.41(G+C)% 因此，DNA 制剂不应保存在离子强度过低的溶液中。 ③ 核酸分子的长度 核酸分子越长， Tm 值越大 ④ 溶液的离子强度 离子强大较低时，Tm 较低，熔解温度范围也较宽；反之，Tm 较高，熔解温度范围也较窄。 （二）变性 DNA 的复性 (renaturation) 1 、定义 2、复性速度 ●加热变性的 DNA 经缓慢冷 却后可复性，此过程称之为 “退火” （annealing） 。 ●快速降温不能使变性的 DNA 复性，依然维持不规则线 团，此过程称为 “淬火”。 退火 变性核酸的互补链在适当条 件下重新缔合形成双螺旋的过 程称为复性。 1 、定义： 复性速度的影响因素： 2、复性速度（－dC /dt ）： 反应体系中单链 DNA 的减小速度 ① 温度和时间 ② 单链 DNA 浓度 ④ 维持一定的离子强度 ③ 单链 DNA 片段长度 ⑤ DNA 片段的均一性（或复杂程度） ① 温度和时间 ●复性温度： Tm－25（℃）为宜 ●降温时间不宜太短，即应缓缓降温 若在超过 Tm 的温度下迅速冷却至低温 (如 4 ℃以下) ， 复性几乎是不可能的，核酸实验中经常以此方式保持 DNA 的变性 (单链) 状态。 －dC / dt = kC2 C：以摩尔核苷酸表示的单链DNA 浓度 k：反应动力学常数 溶液中 DNA 单链片段越多，相互碰撞结合的机会越大，有利于复性。 ② DNA 浓度： ④ 维持一定的离子强度： 可消除链间的负电斥力，加快复性 ③ 单链 DNA 片段长度： 越长，复性越慢；越短，复性越快 ⑤ DNA 片段的均一性（或复杂程度） ●简单顺序的 DNA 分子，如多聚(A)和多聚(U)这二种单链 序列复性时，互补碱基的配对较易实现，而顺序复杂的序列 要实现互补，则困难得多。 ● Cot (Co 为单链 DNA 的起始浓度， t 是以秒为单位的复 性时间) ：表示复性速度与 DNA 顺序复杂性的关系。 在探讨 DNA 顺序对复性速度的影响时，将温度、溶剂离 子强度、核酸片段大小等其它影响因素均予以固定，以不同 复杂程度的核酸分子重缔合部分（即在 t 时间的复性率）对 Cot 作图，可以得到如图下图所示的曲线： ●曲线上方所示不同复杂性的核酸分子的非重复碱基对数 如：多聚 (A) 的复杂性为 1 重复的 (ATGC) n 组成的多聚体的复杂性为 4 分子长度是 105 核苷酸对的非重复 DNA 的复杂性为 105 ●原核生物基因组均为非重复顺序，即非重复核苷酸对表示的复