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第四章 生物免疫分析技术 免疫学方法在食品分析中正得到越来越广泛的运用，其中酶联免疫吸附法（ELISA）已经在食品工业中广泛应用，它能够用于测定人们希望含有的物质，以及不希望含有的物质。例如现在人们所关注的食品安全性问题中一些物质的检测：杀虫剂、药物残留物、激素、生长素、微生物毒素、真菌毒素或肠毒素、天然毒素，以及一些添加剂。 免疫分析法具备有效的灵敏度、特异性、快速和低成本的优点；可对大量的样品进行常规分析；能够用于样品的定性筛选，也能够对样品进行定量测定以确定样品中待测组分的含量。 4.1 免疫的原理 Ag + Ab Ag－Ab 特异性、灵敏性 在Ag，Ab反应中，用容易示踪的化学物质标记一种反应物，以了解反应是否发生，发生部位，以及发生的程度（即对未知成分的样品进行定性、定位及定量分析）。 4.2 酶联免疫法 免疫酶技术：把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用原理有机地结合起来。它具有免疫荧光试验和放射免疫试验的优点，并克服上述两种方法的缺点。 酶标记试剂制备容易、稳定、有效期长，免疫酶技术的敏感性接近放射免疫试验，可直接肉眼观察也可借助简单的仪器作定量测定，所得结果比较客观。 酶免疫测定或免疫酶技术是指酶标记抗体或酶标记抗体进行的抗原抗体反应。它主要包括两个方面： 免疫过氧化物酶法：以过氧化物酶作为标记，与抗原或抗体结合，然后根据酶与其底物间所产生的不溶性颜色产物，借助于光学或电子显微镜观察细胞及亚细胞水平的抗原或抗体。 酶联免疫吸附法：根据可溶性抗原或抗体与不溶性固相载体结合后，还保留其免疫活性，结合了作为标记的酶催化作用。 步骤： A 将已知抗体吸附于载体上，温育后清洗； B 加入待检标本溶液，使溶液中的抗原与吸附的抗体结合，温育后清洗； C 加入酶标记特异性抗体，温育后清洗； D 加入酶作用底物，产生显色反应，颜色的改变与所加的待检标本溶液中的抗原量成正比。 步骤： A 将已知可溶性抗原吸附于载体（聚苯乙烯板或聚乙苯乙烯小珠），经温育后清洗； B 加入待检稀释血清，若血清中有相应特异性抗体存在则与吸附的抗原结合，温育后清洗； C 加入酶标记的抗球蛋白抗体，此时酶标记抗抗体与吸附的抗原抗体复合物结合，温育后清洗； D 加入酶作用底物（或称基质），酶分解底物并显色，用光电比色计测定底物显色深浅，即可推知抗体量。 步骤： A 将已知抗体吸附于固相载体表面，温育后清洗； B 将可能含抗原的待检溶液和酶标记的已知抗原溶液以适当比例混合，加入已包被的载体孔中，温育后清洗； C 加入酶作用的底物，产生显色反应。色深表示结合的酶标记抗原多，而待检溶液中未标记的抗原量少；反之，色浅表示结合的酶标记抗原少，而待检溶液中抗原量多。 4.3 放射免疫法 放射免疫测定（radioimmunoassay，RIA）是1959年由Berson和Yalow首先用于糖尿病患者胰岛素含量的测定，是一种将同位素分析的灵敏性和抗原抗体反应的特异性这两大特点结合起来的免疫标记测定技术。 其优点是灵敏度高、特异性强、精确性好、样品用量少，而且不需要复杂的提纯步骤。缺点是需要特殊的仪器设备和一定的防护条件，而且有些同位素标记物的半衰期较短以及试验废物难以处理，对环境造成放射性污染。 放射免疫测定法 基本原理 放射免疫测定是建立在待测抗原和标记抗原对有限量抗体进行竞争性结合的基础上。待测抗原是指人体内某种微量活性物质（如微生物＆寄生虫抗原、激素、维生素、酶、药物等），而标记抗原使将已知的上述物质标记上放射性同位素，具有示踪作用。 将标记抗原（Ag*）和未标记抗原（Ag）与特异性抗体（Ab）相混合，结果形成标记的和未标记的抗原抗体复合物。标记和未标记的抗原竞争与抗体进行结合的现象，成为竞争性抑制作用。 Ag* + Ab Ag*-Ab 标记抗原 特异性抗体 标记抗原抗体复合物 + Ag 非标记抗原 Ag-Ab 非标记抗原抗体复合物 4. 4 荧光免疫法 免疫荧光技术是根据抗原抗体反应具有高度的特异性，以荧光素（常用的有异硫氰酸荧光黄FITC和罗丹明RB200)作为标记物，与已知抗体结合。然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于鉴定未知的抗原，可在荧光显微镜下检查呈现荧光的特异性抗原抗体复合物及其存在部位。 DNM-9602G酶标分析仪 DNM-9602