第六章化学物质与蛋白质的相互作用34节.pptVIP

* 第三节 化学物质对蛋白质侧链基团的共价修饰作用 Covalent modification of protein side-chain groups by chemicals 化学物质的共价修饰作用 化学物质与生物大分子的共价作用常常涉及到物质的生理活性（包括药理、毒理等），如何判断化合物与蛋白质分子中的哪类基团作用，在体外主要用化合修饰的方法。 该方法是研究蛋白质结构与功能的一种重要的基础手段。 一、生物体内蛋白质加合物的形成 许多化学毒物对细胞产生的损害与其亲电代谢产物同细胞大分子的亲核部位(如蛋白质的巯基)发生不可逆结合具有密切关系。 当外源化合物的活性代谢产物与细胞内重要生物大分子，如核酸、蛋白质、脂质等共价结合，发生烷基化或芳基化，即导致DNA损伤、蛋白质正常功能丧失，乃至细胞的损伤或死亡。 外源化合物与生物大分子相互作用主要有两种方式：非共价结合和共价结合。 1、可与蛋白质发生反应的化合物 除少数烷化剂外，绝大多数外源化合物需经体内代谢活化，转变成亲电子的活性代谢物，再与细胞内生物大分子中的亲核部位和基团发生共价结合。 例如蛋白质分子中的亲核基团、DNA、RNA及一些小分子物质如谷胱甘肽等的亲核部位等。 试剂类型 化合物或前体 反应机制 烷基化 芳香基化 卤代物 亲核取代 环氧化物 硫酸烷基酯 活泼的烯烃 1,4-加成 羰基化合物 醛 形成席佛碱 酰基化 有机酸酐、酰氯等 亲核取代或加成 磷酰化 有机磷 亲核取代 自由基 ·OH、·CCl3 自由基反应 具有亲电氮化合物 芳香胺 亲核取代 表6-1 可与蛋白质形成共价加合物的化合物类型 2、蛋白质分子中的可反应基团 蛋白质分子中有许多功能基团可与外源化合物相互作用，除各种氨基酸分子普遍存在氨基和羧基外，丝氨酸和苏氨酸所特有的羟基、半胱氨酸分子中得巯基….. 一旦这些部位与外源化合物发生共价结合，必将影响蛋白质结构和功能。 致癌物分子量的大小不同，反应是不同的，分子量较小的，如乙烯、丙烷和苯乙烯的氧化物、尿烷和氯乙烯的环氧化物、丙烯酰胺等，与蛋白质作用时，所形成的加合物依赖于外源化合物与各种氨基酸反应的相对速率。 3、与白蛋白的共价结合 白蛋白是血液和组织间质中的主要蛋白质，也是脂肪酸、内源性（生物体内存在的）化合物及外源性运输的主要载体，它容易与终致癌物结合形成共价加合物。 5、与细胞内蛋白质共价结合 进入体内的外源化合物或其代谢产物可与胞浆、质膜以及细胞核内蛋白质发生共价结合而形成加合物，已经发现有数十种外源化合物与蛋白质共价结合与其毒性有密切关系。 溴苯是一种重要的肝脏毒物，进入体内后经细胞色素P450作用形成溴苯-3,4-环氧化物，可与蛋白质、DNA等共价结合。 4、与血红蛋白的共价结合 外源化合物进入血液后，可与红细胞膜结合而进入红细胞内与血红蛋白发生共价结合。其中血红蛋白氨基酸中的氨基、巯基易与外源化合物发生共价结合。 烷基化试剂可与血红蛋白末端氨基酸的氨基、半胱氨酸的巯基以及组氨酸咪唑环上N1或N3共价结合。 环氧乙烷、环氧丙烷可与血红蛋白中组氨酸、末端氨基酸残基共价结合； 4-氨基联苯、苯胺经体内代谢氧化后可与半胱氨酸的巯基结合。 蛋白质侧链基团的修饰是通过选择性的试剂或亲和标记试剂与蛋白质分子侧链上特定的功能基团发生化合反应而实现的。其中的一个重要作用是用来探测活性部位的结构。 理想情况下，修饰试剂只是有选择地与某一特定的残基反应，很少或几乎不引起蛋白质分子的构象变化。 在此基础上，从该基团的修饰对蛋白质分子的生物活性所造成的影响，就可以推测出被修饰的残基在该蛋白质分子中的功能。 二、特定的氨基酸残基侧链基团的修饰 1、巯基的化学修饰 烷基化试剂是一种重要的巯基修饰试剂，如碘乙酸和碘乙酰胺，用于多肽链氨基酸顺序分析过程防止半胱氨酸的氧化。 5,5-二硫-2-硝基苯甲酸(DTNB)，又称为Ellman试剂，目前已成为最常用的巯基修饰试剂。DTNB可与巯基反应形成二硫键，产生的5-巯基-2-硝基苯甲酸阴离子在412nm具有很强的吸收，可以很容易通过光吸收的变化来监测反应的程度。 有机汞试剂是最早使用的巯基修饰试剂之一，其中最常用的是对氯汞苯甲酸，该化合物溶于水中形成羟基衍生物，与巯基相互作用时在255nm处光吸收具有较大的增强效应。 2、氨基的化学修饰 有许多化合物都可用来修饰赖氨酸残基，三硝基苯磺酸(TNBS)就是其中非常有效的一种。TNBS与赖氨酸残基反应，在420 nm和367nm能够产生特定的光吸收。 在蛋白质序列分析中，用于多肽链N-末端残基的测定的化合修饰方法--2，4-二硝基氟苯(DNFD)法、丹磺酰氯(DNS)法和苯异硫氰酸酯(PITC)法都是