Asia-1型犬瘟热病毒分离株H蛋白免疫原性分析及重组犬腺病毒2型的构建.pdf

摘 要 摘 要 犬瘟热 (Canine distemper ，CD)是由犬瘟热病毒 (Canine distemper virus ，CDV)感染引起 的犬及其他肉食动物的一种急性或亚急性、高度接触性传染性疾病，是我国当前对养犬业、 毛皮动物养殖业和野生动物保护业危害最大的疫病之一。常规弱毒疫苗虽然在CD 防控中发 挥了非常重要的作用，但是也存在诸多缺点。加之犬瘟热病毒对流行因素的逐渐适应以及大 量变异株的出现，全球范围内，犬瘟热的感染呈上升趋势，且其中有很多是免疫群体爆发犬 瘟热的报道。因此，有必要寻求更加安全、有效的影响新型疫苗。 本研究首先对Asia-1 型犬瘟热病毒分离株 (HLJ2-07 株) 优势保护性抗原基因－H 蛋白 基因进行了序列测定、遗传进化分析、真核表达和重组质粒 DNA 的小鼠免疫试验，初步验 证其免疫原性。并在此基础上把H 基因定向克隆入本实验室已构建完成的通用转移载体pUC- △E3-EGFP 中，构建了含有犬瘟热病毒H 基因的转移载体pUC-2△E3-H 。对实验室已构建的 表达绿色荧光蛋白的重组犬腺病毒2 型rCAV-△E3-EGFP 进行了蚀斑筛选、纯化和PCR 鉴定， 对纯化完全的病毒进一步进行了生物学特性分析（形态学鉴定、重组病毒与亲本毒株的病毒 滴度比较、生长特性分析、遗传稳定性分析）。最后以转移载体pUC-2△E3-H 转染rCAV-△ E3-EGFP 感染的COS-7 细胞，经体内同源重组，获得了表达犬瘟热病毒 H 蛋白的重组犬腺 病毒2 型rCAV-2△E3-H 。 序列测定结果显示：H 基因全长1824 bp，编码607 个氨基酸，含有9 个潜在的N-联糖 基化位点和12 个半胱氨酸残基。同源性分析表明：CDV HLJ2-07 株与Onderstepoort、Convac 疫苗株亲缘关系最远，核苷酸同源性仅为91.4%和91.3%；系统进化分析显示：HLJ2-07 株属 Asia-1 型；与32 株中国分离株比对，显示目前国内大部分分离株属于Asia-1 型。由此，一 方面说明，基因型的改变可能是H 蛋白抗原性变化的一个重要原因。另一方面，显示出从国 内主要流行株中选取合适毒株，构建疫苗的必要性和必需性。H 蛋白的真核表达及免疫原性 分析结果显示：pcDNA3.1-H 免疫组血清可与感染已知HLJ2-07 株病毒的MDCK-SLAM 细胞 发生特异性 IPMA 反应，染色后使细胞呈现阳性的棕红色，证明免疫动物后可产生抗 CDV 抗体；ELISA 血清抗体滴度可达1：28～1：79 ；病毒中和抗体可达1：11～1:32，表明H 蛋 白具有免疫原性。重组病毒rCAV-△E3-EGFP 的感染MDCK 细胞后，待出现 90% 以上细胞 病变时收获病毒，经数次蚀斑筛选和纯化，PCR 鉴定，最终达到纯化完全，生物学特性研究 显示，EGFP 基因的插入和E3 区的缺失不影响重组病毒的增殖特性，其毒力、生长特性与亲 代病毒CAV-2 相似，保持原有疫苗株的生长特性，且在MDCK 细胞上连续传代25 代遗传性 状稳定，显示出一定得应用前景。基于重组病毒 rCAV-△E3-EGFP ，我们经构建好的转移载 体pUC-2△E3-H 经纯化后用脂质体法转染感染了rCAV-△E3-EGFP 的COS-7 细胞，病变明 显时收毒，经蚀斑纯化和PCR 鉴定，获得重组病毒rCAV-△E3-H 。通过PCR 、IFA 鉴定，重 组病毒能表达CDV H 蛋白。 本研究在对本室分离的犬瘟热病毒HLJ2-07 株 H 基因进行了克隆及序列分析的基础上， 进行了真核表达和免疫原性评估，纯化了表达 EGFP 基因的重组病毒 rCAV-△E3-EGFP ，并 在此基础上成功构建了表达H 蛋白的重组犬腺病毒2 型载体，为下一步的重组腺病毒在遗传 稳定性、生长动力学及试验免疫研究奠定基础。 I 东北农业大学农学硕士学位论文 关键词：犬瘟热；犬腺病毒2 型；重组病毒；H 基因；真核表达； II