各种同工酶的染色方法.doc

各种同工酶的染色方法 一、淀粉酶 ⑴、制胶方法： 分离胶（6%）： 分离胶贮液：2.95 mL Tris-柠檬酸（pH8.9）：10.95 mL 2%Na2SO4：0.4 mL 1%过硫酸铵：0.4 mL TEMED：20 μL 配制方法： 分离胶贮液（30%Acr-0.8%Bis贮液）：30 g Acr + 0.8 g Bis加重蒸水50 mL（可加热溶解） → 定溶至1000 mL（pH 4.8～5.1，冰箱内可放置2～3个月） Tris-柠檬酸（pH8.9）：15.5 g Tris + 1 g 柠檬酸（C6H8O7·H2O）加重蒸水溶解，调pH至8.9（用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl调），最终定溶至1000 mL，滤纸过滤后置冰箱中保存。 2%Na2SO4：1 g Na2SO4加重蒸水定溶至50 mL，冰箱中可保存1个月。 1%过硫酸铵：0.5 g过硫酸铵加重蒸水定溶至50 mL，冰箱中可保存1周。 浓缩胶（3%） 分离胶贮液：2.0 mL Tris-柠檬酸（pH6.8）：2.0 mL 2%Na2SO4：0.2 mL 蒸馏水：14.8 mL 1%过硫酸铵：0.6 mL TEMED: 30 μL 配制方法： 浓缩胶贮液：同分离胶贮液。 Tris-柠檬酸（pH6.8）：1.55 g Tris + 0.1 g 柠檬酸（C6H8O7·H2O）加重蒸水溶解，调pH至6.8，最终定溶至100 mL，滤纸过滤后置冰箱中保存。 ⑵、染色方法： 1%可溶性淀粉（一定要在沸水中煮沸到无色透明无沉淀为止），均匀地涂倒在胶板面上。静置1小时。 用0.15mol/L HAc缓冲液（pH 5.0）洗去胶板表面剩余的淀粉，然后加100 mL 0.15 mol/L HAc缓冲液（pH 5.0），在37℃温箱保温1.5小时。 加显色碘液10 mL，在兰色背景上出现白色透明、粉红、红或褐色条带，即为淀粉酶。 配制方法： 1%可溶性淀粉：0.1 g可溶性淀粉溶于10 mL pH8.9的Tris-柠檬酸缓冲液中，在水浴中煮沸，搅拌到完全透明无沉淀为止：——本试剂需随配随用。 0.15mol/L HAc缓冲液（pH 5.0）：称取11.9 g NaAc，加重蒸水溶解，用冰HAc调pH至5.0，最终加重蒸水至1000 mL。 显色碘液：称取KI 15.8 g，加到10 g 碘溶液中（先在95%乙醇中溶解），最终加重蒸水至1000 mL，用时稀释20倍。 ⑶、保存液： 固定液：冰醋酸 : 甲醇 : 水 = 40 : 100 : 320 ⑷、电极缓冲液贮液： 采用低离子强度电极缓冲液，称取6.2 g Tris，加入2.0 g Gly，加重蒸水定容至1000 mL，用时稀释5倍，pH值8.7。 ⑸、2%溴酚蓝溶液： 称取1.0 g溴酚蓝加蒸馏水至50 mL。 二、过氧化氢酶： ⑴、制胶方法： 分离胶（7%，20 mL） 分离胶贮液：4.5 mL 1 mol/L Tris-HCl（pH8.8）：7.5 mL 重蒸水：7.5 mL 1%过硫酸铵：0.5 mL TEMED：35 μL 配制方法： 分离胶贮液：同上 1 mol/L Tris-HCl（pH8.8）缓冲液：称取121.14 g Tris放入1000 mL烧杯中，加重蒸水800 mL溶解，用浓HCl调至pH8.8，倒入1000 mL容量瓶，定容至1000 mL，滤纸过滤，冰箱中可保存3个月。 浓缩胶（4%，10mL） 分离胶贮液：1.3 mL 1 mol/L Tris-HCl（pH6.8）：1.3 mL 重蒸水：6.4 mL 1%过硫酸铵：1.0 mL TEMED：10.0 μL 配制方法： 浓缩胶贮液：同分离胶贮液。 1 mol/L Tris-HCl（pH6.8）：称取12.114 g Tris放入100 mL烧杯中，加重蒸水溶解，用浓HCl调至pH6.8，倒入100 mL容量瓶，定容至100 mL，定性滤纸过滤，冰箱中可保存3个月。 ⑵、染色方法： 用蒸馏水将电泳胶板冲洗1～2次，然后用0.3% H2O2 溶液100 mL浸泡胶板1～5分钟，在浸泡过程中不断振荡染色盘使之浸泡均匀。 浸泡结束，倒掉过氧化氢溶液，并用蒸馏水将胶板冲洗1～2次。再用4%可溶性淀粉溶液100 mL（染色前一天配置更好）浸泡胶板1小时。 浸泡结束，倒掉淀粉溶液，用蒸馏水把胶板冲洗1～2次。再用50 mL 2%铁氰化钾和50 mL 2%三氯化铁混合物进行负染色10分钟，待胶板在草绿色背景上出现浅黄色酶带时停止染色，倒掉染色液，水洗胶板1～2次。 配制方法： 0.3% H2O2：1 mL 30% H2O2，加重蒸水至100 mL。 4%可溶性淀粉溶液：4 g可溶性淀粉溶于100 mL pH8.8 Tris-HCl缓冲液中，