酶学与酶工程第四章酶的提取与分离纯化学生.ppt

* 流体名称 临界温度(℃) 临界压力 (Mpa) 临界密度 （g/ml） 乙烷C2H6 32.3 4.88 0.203 丙烷C3H8 96.9 4.26 0.220 丁烷C4H10 152.0 3.80 0.228 戊烷C5H12 296.7 3.28 0.232 乙烯C2H4 9.9 5.12 0.227 氨NH3 132.4 11.28 0.236 二氧化碳 CO2 31.1 7.38 0.46 二氧化硫 SO2 157.6 7.88 0.525 水H2O 374.3 22.11 0.326 笑气N2O 36.5 7.17 0.451 氟里昂C 28.8 3.90 0.578 某些超临界流体的超临界点和超临界密度 4．反胶束（团）萃取法 反胶团，又称反胶束，是指表面活性剂分散在连续有机相中自发形成的一种稳定的纳米级的聚集体。 反胶团萃取法是近年发展起来的另一种新型萃取分离技术，在分离生物大分子特别是分离蛋白质方面取得了很大的进展。反胶团萃取法具有成本低、溶剂可反复使用、萃取率和反萃取率都很高等突出的优点，另外此法还能解决胞内酶在非细胞环境中迅速失活的问题，而且由于构成反胶团的表面活性剂往往具有溶解细胞的能力，因此可用于直接从完整细胞中提取蛋白质和酶。 * 微团： 表面活性剂的极性头朝 外，疏水的尾部朝内，中 间形成非极性的“核” 水 非极性的“核” 极性“头” 非极性“尾” 反微团： 表面活性剂的极性头朝内，疏水的尾部向外，中间形成极性的“核” 有机溶剂 极性“头” 极性的“核” 非极性“尾” 反胶团萃取蛋白质示意图 蛋白质的溶解 a、水壳模型：蛋白质位于水池的中心，周围存在的水层将其与反胶团壁隔开； b、半岛模型：pro表面存在强烈疏水区，该区直接与有机相接触； c、pro吸附于反胶团内壁； d、pro疏水区与几个反胶团的疏水尾发生相互作用，被几个小反胶团所“溶解”。 五、结晶 结晶是指物质以晶体的状态从蒸汽或溶液中析出的过程。结晶既是酶是否纯净的标志（只有同类分子才能形成晶体），也是一种酶和杂蛋白分离的方法。 1.原理 酶从溶液中结晶析出是一个新的固相形成的过程，包括酶分子的凝聚和有规则地排列在一定晶格中；形成新的固相需要一定的表面自由能，当溶液达到饱和状态时开始结晶作用，但只有当达到过饱和状态时才可能析出结晶；因此结晶包括3个过程：形成过饱和溶液，形成晶核，晶体生长。需要注意的是过饱和状态的形成应该是一个缓慢的过程，否则会形成无规则的沉淀而不能形成晶体。 * 2. 结晶条件 1）酶的纯度 达到50%以上 2）酶的浓度 溶液浓度控制稍微过饱和的状态 3）结晶温度 低温下进行结晶（0-40C）； 4）溶液pH 应在酶的稳定范围内，一般选在被结晶的pI值附近； 5）离子强度 （ 如Ca 2+ , Mg 2+ 等） 6）晶核 7）结晶时间 3. 结晶方法 * 第三节酶的浓缩与干燥 一、浓缩 浓缩就是从的低浓度酶液中除去部分水分或其它溶剂而成为高浓度酶液的过程。 真空蒸发浓缩 薄膜蒸发浓缩 二、干燥 干燥：将固体、半固体或浓缩液中水分（或其他溶剂）除去一部分，以获得含水量较少的固体过程。 真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥和吸附干燥。 * 三、酶的制剂与保存 酶的制剂与保存 液体酶制剂：一般将固体杂质去除后，直接制成或浓缩成粗酶液；不稳定，且成分复杂。 固体酶制剂：发酵液经杀菌后直接浓缩或喷雾干燥而成；有的是经过初步纯化后，加入淀粉等填充料而成；适合运输和短期保存，用于工业生产。 纯酶制剂：分离纯化后的酶液，经浓缩或结晶等制成；适合于生化试剂或医疗药物。 固定化酶制剂： * 酶的稳定性 1、影响酶稳定性的因素：温度（0-4 0C或更低），pH 与缓冲液，酶浓度（高稳定），氧。 2、酶的稳定剂：底物，抑制剂和辅酶；巯基保护剂（如巯基乙醇，谷胱甘肽，二硫苏糖醇等）；无机离子（如Ca 2+保护?-淀粉酶 , Mn 2+ 保护溶菌酶 ）；表面活性剂（如1%的苯烷水溶液）；高分子化合物（血清蛋白，多元醇，甘油等）；苯甲酸等防止微生物对酶制剂的污染。 * * 过滤的分类及其特性 (根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同 ) 类别 截留颗粒大小 截留的主要物质 过滤介质 粗滤 2μm 酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等 滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、烧结金属等 微滤 0.2～2μm 细菌、灰尘等 微滤膜、微孔陶瓷 超滤 20?～0.2μm 病毒、生物大分子等 超滤膜 反渗透 20? 生物小分子、盐、离子 反渗透膜 借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。膜分离所使用的薄膜主要是由丙