植物乳杆菌ZS2058中亚油酸异构酶的分离纯化及其酶学性质的分析研究.pdfVIP

摘要 摘要 Linoleic Acid，LA)衍生的 共轭亚油酸(ConjugatedAcid，CLA)是亚油酸(Linoleic 共轭双烯酸的多种位置与几何异构体的总称。它具有多种营养和保健功能，如抗癌、抗 动脉粥样化和延缓机体免疫力衰退、减肥等。在共轭亚油酸的各种异构体中c9，t11-CLA 被认为最具有生物活性。利用乳酸菌进行生物转化共轭亚油酸由于反应条件温和，产物 异构体较单一，以及易于操作和控制，成为了当前生物转化共轭亚油酸领域的一个研究 热点。而亚油酸异构酶作为乳酸菌生物转化共轭亚油酸的一个关键酶，近来也成为了研 究的一个焦点。 植物乳杆菌ZS2058是本实验室从泡菜中筛选到的一株具有亚油酸异构酶活性的乳 酸菌。采用超声波破碎和溶菌酶消化相结合的方法来对植物乳杆菌ZS2058中的亚油酸 异构酶进行提取，超声波法提取该亚油酸异构酶的最佳条件是：破碎功率400W，破碎时 不同组分进行酶活检测，发现膜沉淀组分中的亚油酸异构酶活性占所有组分总酶活的 X．1 70％。因此，该亚油酸异构酶为膜结合蛋白。又通过研究Triton00和NaCI对该亚油 酸异构酶粗酶液活性的影响，进一步证实了该亚油酸异构酶为膜结合蛋白，而且是一种 膜内在蛋白。对亚油酸异构酶粗酶性质的研究发现，底物LA浓度对亚油酸异构酶活性 的影响非常显著，当亚油酸的浓度高于0．08mg／mL时，亚油酸异构酶的活性会受到很明 显的抑制；而加入5％的甘油则能增强粗酶液中亚油酸异构酶的稳定性。 本文对该亚油酸异构酶的分离纯化进行了研究。硫酸铵分级沉淀的硫酸铵饱和度适 宜取值范围为20％．50％；阴离子交换层析采用梯度洗脱的方法，当缓冲体系Tris．HCl 缓冲液(20raM，1％Triton 浓度为O．12M处被洗脱下来，并获得了较好的纯化效果。亚油酸异构酶粗酶液经硫酸铵 分级沉淀、阴离子交换层析和凝胶过滤层析后，得到了电泳纯的亚油酸异构酶，纯化倍 为66kDa。 本文又对纯化后的亚油酸异构酶的酶学性质进行了研究。研究结果表明，该亚油酸 异构酶的最适温度为35℃，最适pH为5．5；该亚油酸异构酶的耐热性较差；多种金属 离子对亚油酸异构酶活性的影响均不显著；金属螯合剂EDTA和EGTA对亚油酸异构酶 活性的影响不显著；多种辅酶因子对亚油酸异构酶活性的影响也不显著；通过采用 x Vm瓠=3．7110’9moV(min．rag)。 关键词：共轭亚油酸，植物乳杆菌，亚油酸异构酶，膜结合酶，分离纯化，酶学性 质 Abstract Abstract linoleic to and isomersoflinoleic Conjugated acid(CLA)refers geometricpositional two double discoveredasa acid(LA)with conjugated naturally bonds．Originally occurring hasbeen to showlowercancer and anticarcinogen，CLA risk，enhance subsequently immunity reduce t