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套式PCR检测非淋球菌性尿道炎中生殖支原体及解脲支原体
套式PCR检测非淋球菌性尿道炎中生殖支原体及解脲支原体[摘要] 目的:采用nPCR技术,对在本院确诊的非淋球菌性尿道炎(NGU)患者的泌尿生殖道分泌物标本进行检测,以探讨套式PCR(nPCR)技术在生殖支原体(Mg)和解脲支原体(Uu)检测中的作用和地位。方法:深圳市福田区NGU患者98例,宫颈或尿道口内拭子分泌物标本用nPCR进行DNA扩增,并与对照组43例进行比较。结果:98例标本中Mg阳性15例,阳性率为15.3%,正常对照组无一例阳性。Uu阳性21例,阳性率为21.4%,对照组仅1例阳性。结论:深圳福田区Mg、Uu在NGU中具有较高的感染率,nPCR具有敏感、快速、特异性强等特点,可用于临床辅助诊断和流行病学调查。
[关键词] 生殖支原体;解脲支原体;套式PCR;非淋球菌性尿道炎
[中图分类号] R375 [文献标识码]B [文章编号]1674-4721(2010)03(a)-069-02
生殖支原体(Mg)和解脲支原体(Uu)是引起非淋球菌性尿道炎(NGU)的主要病原体之一,由于其培养费时且敏感性低,严重阻碍了其在临床诊断中的研究[1],自PCR技术问世以来,基因诊断已经成为支原体感染较为理想的诊断方法。因PCR仅需少量标本,且无需提纯标本DNA(简单裂解即可),检测的灵敏度和特异性均大于DNA探针杂交法,因此得到了迅速的推广和应用[2]。为了进一步探讨套式PCR(nPCR)在临床诊断中的应用价值,笔者应用nPCR检测了2005~2007年来本院就诊的98例NGU患者,现将初步结果报道如下:
1 资料与方法
1.1 标本来源
2005~2007年从深圳市福田区中医院皮肤性病科门诊临床诊断为NGU的患者98例,其中,男性61例(19~56岁),女性37例(17~49岁),有性乱史者41例,受检者均在15 d内未用过抗衣原体、支原体药物。正常对照组43例,男21例,女22例,年龄19~30岁,均为体检或门诊就诊孕妇。
1.2 取材方法
标本采集用无菌棉拭子,男性插入尿道2~3 cm,女性插入宫颈内1~2 cm,置留20~30 s,并旋转3圈后取出,置-20℃温度下备用。
1.3 标本处理
样品采集后将其置于1 ml无菌0.9%氯化钠溶液中充分悬浮,1 000 rpm离心5 min,弃上清液,沉淀物中加入50 μlDNA提取液悬浮沉淀物。100℃温度下放置10 min,1 000 rpm离心5 min,取2 μl模板上清液加入各自动反应管供nPCR用。
1.4 主要仪器设备
PCR仪,德国Eppendorf公司;DYY-Ⅲ型电泳槽,北京六一仪器厂;Gel Doc 2000凝胶成像系统,美国BIO-RAD公司。
1.5 引物和探针
根据Mg和Uu的16 S rRNA设计特异性引物。外套通用引物为,上游:GAGTTTGATCCTGGCTCAGG,下游:ATTACCGCGGCTGCTGGCAC。内套为,Mg,上游:GCCATATCAGCTAGTTGGT,下游:CTCCAGCCATTGCCTGCTA,产物为242 bp;Uu,上游:GCGGCATGCCTAATACATGC,下游:CTTATTCAAATGGTACAGTCAA,产物为435 bp。
1.6 nPCR反应
第一次扩增:25 μl反应体系中含2.5 μl 10×Tag聚合酶缓冲液,200 μM dNTP, 1 μM引物浓度,1 U Tag DNA聚合酶,10 μl模板DNA。93℃温度下变性2 min,随后93℃温度下放置30 s,55℃温度下放置30 s,72℃温度下放置1 min,扩增35个循环,最后于72℃温度下放置1 min,取10 μl直接点样电泳100 V,10~20 min,于凝胶成像系统下拍照观察,有阳性条带为阳性。每次实验设立阳性和阴性对照。
2 结果
2.1 nPCR检测NGU结果
98例NGU患者Mg和Uu阳性率分别为15.3%和21.4%。
2.2 正常对照组nPCR结果
43例NGU患者Mg和Uu阳性率分别为0和2.3%。
3 讨论
性传播疾病(STD)的发病率近年呈上升趋势,其原因很大程度上归因于缺乏特异、敏感的检测方式而被临床忽视[3]。自20世纪人类首次从患者泌尿生殖道分离出Mg和Uu以来,学者对它的生物学特性和致病性进行了许多研究。Uu和Mg感染往往无特异的临床表现,同时由于其分离培养困难,如Mg往往需要1~2个月才有培养基颜色的改变,因此给临床研究带来了很大困难[4]。若不及时采取有效的治疗,部分感染者可能会出现宫颈炎、盆腔炎,有的甚至引起流产、胎儿畸形等严重后果[5]。因此对于NGU患者应引起高度重
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