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RNA干扰iRNA技术及其应用 摘要：RNA干扰(interference RNA，iRNA)是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象，它是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象，这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默。RNA具有特异性和有效性。iRNA技术作为功能基因组学强有力的研究工具，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低突变。随着对现代分子生物学研究的发展，该技术的应用领域逐步扩展到医学，农业，林业，渔业，畜牧等多个领域，具有巨大的科研，经济和社会价值，本文主要论述RNA干扰技术在医学领域方面的应用。 关键字：RNA干扰 转录后基因沉默 RNA 诱导的沉默复合物 正文：今年来，对RNA干扰技术的研究已经成为热点，预测未来10年间最后可能出重要成果的领域之一，并被《Science》评选为2002年度最重要科技突破的首位。RNA干扰技术之所以有如此重要的地位，与其运用到的领域有关。21世纪初，人类完成了基因组计划，破译人类全部的遗传信息，使人类第一次在分子水平上全面认识自我。因此，很多疾病的病因也将揭开神秘的面纱，这位这些疾病的基因诊断和基因治疗奠定了基础。因此，利用RNA干扰技术抑制基因组的基因表达的技术手段，有可能在基因治疗方面开辟一条心的途径，克服医学上许多疑难杂症，例如，病毒性疾病，肿瘤心血管疾病和遗传性疾病。 1.RNA干扰的发现:首次发现dsRNA能够导致基因沉默的线索来源于线虫Caenorhabditis elegans的研究。1995年，康乃尔大学的Su Guo博士在试图阻断秀丽新小杆线虫(C.elegans)的par-1基因时，发现了一个意想不到的现象。她们本想利用反义RNA技术特异性地阻断上述基因的表达，而同时在对照实验中给线虫注射正义RNA以期观察到基因表达的增强，但得到的结果是二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。这是与传统上对反义RNA技术的解释正好相反。该研究小组一直未能给这个意外以合理解释。这个奇怪的现象直到3年后才被解开。1998年2月，华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fire和马萨诸塞大学癌症中心的Craig Mello才首次揭开这个悬疑之谜。通过大量艰苦的工作，他们证实，Su Guo博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。当他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。实际上每个细胞只要很少几个分子的双链RNA已经足够完全阻断同源基因的表达。后来的实验表明在线虫中注入双链RNA不单可以阻断整个线虫的同源基因表达，还会导致其第一代子代的同源基因沉默，该小组将这一现象称为RNA干扰。现在RNA干扰现象广泛存在于从植物、真菌、线虫、昆虫、蛙类、鸟类、大鼠、小鼠、猴一直到人类的几乎所有的真核生物中细胞，这种情况揭示了iRNA现象很可能出现于生命进化的早期阶段。后来在果蝇细胞中的实验进一步揭示这个秘密。在一系列著名的实验中，Zamore 和同事发现注入果蝇细胞的dsRNA被切割为21～23碱基长短的RNA片段，他们同时发现：与dsRNA同源的内源基因的mRNA，只在和dsRNA对应的部位被切割成为21—23核苷酸长的片断。很快，iRNA的机制越来越清楚了。 2.iRNA干扰作用机制： iRNA 的作用体现在两种水平上。①转录水平。RNA 可以介导DNA 的甲基化最早发现于一种植物的类病毒系统。dsRNA 被降解成21～23 个核苷酸长的小片段RNA 时，这些小的RNA 分子在细胞核可以诱发同源序列的DNA 甲基化 。这种序列特异性的甲基化的信号与RNA-DNA 结合有关 。当dsRNA 含有与启动子同源的序列，即可使同源靶启动子序列甲基化，从而使靶启动子失去功能，导致下游基因沉默。②转录后水平。(1)特异切割dsRNA 的RNA 酶Ⅲ家族核酸酶Dicer 依赖ATP 切割dsRNA ，将其分解成具有2 个核苷酸的3’端 的19～21b 小片段的双链siRNA。(2)RISC(RNA 诱导的沉默复合物) 识别并降解mRNA。RISC 是一种蛋白-RNA 效应器核酸酶复合物。双链siRNA 为RISC 的重要组分，它依赖ATP 解旋导致RISC活化，然后通过Waston-Crick 碱基配对识别底物mRNA 并与之结合，并自siRNA 的3’端将mRNA 切割成小于12nt 的片段使其降解 。对一些人组织因子的试验表明，几个不同的siRNA 可以攻击同一个mRNA 的不同位点。