蛋白质多肽氨基酸组成序列分析.docVIP

第十章 蛋白质、多肽的氨基酸组成及序列分析 氨基酸是组成肽和蛋白质的基本单位,也是生物体维持生长所必需的营养物质，它们参与机体的代谢过程，具有广泛的生物活性和特殊的生理功能。在对肽和蛋白质的结构和功能进行研究时，往往需要将其进行完全水解，测定其氨基酸的组成；生物体内游离氨基酸在神经信息传递、代谢的调节以及肽、蛋白质的合成等生理过程中起着重要作用，为了了解其生理功能及某些外源性刺激对其功能的影响，也需要对生物体液、细胞或组织内的游离氨基酸进行分析。除了氨基酸总量测定外，往往更需要对个别氨基酸进行分析。常用的氨基酸分析方法可归纳为两类：衍生化间接分析法和无需衍生化的直接分析法。 蛋白质的一级结构即蛋白质中多肽链氨基酸的排列顺序，既是研究蛋白质分子高级结构和功能的基础，又有助于蛋白质的基因结构的研究。在某些特定情况下，基因突变常常导致蛋白质中氨基酸的序列发生改变，从而引起功能失调和疾病产生。因此，测定蛋白质的氨基酸序列对新的诊断学方法开发、新的治疗方法建立有重要的意义。 无论是游离氨基酸还是水解氨基酸的测定，由于多数氨基酸都缺少结构检测特征，既无紫外吸收，又无荧光，必须使之衍生，转化为具有紫外可见光吸收或能产生荧光的物质才能检测分析。 §10. 1. 1 氨基酸的衍生化反应 为了使测定氨基酸的方法灵敏度高，分辨率好，氨基酸的衍生化是关键步骤之一。近年来人们致力于开发灵敏度高、衍生操作简单、形成的氨基酸衍生物稳定的衍生化试剂。常见的衍生化试剂有茚三酮、邻苯二甲醛（OPA）、丹酰氯（Dansyl-Cl）、异硫氢苯酯（PITC）、氯甲酸芴甲酯（FMOC-Cl）等。 茚三酮在酸性（pH = 3 ~ 4）和加热条件下与氨基酸反应生成氨、二氧化碳和蓝－紫色的复合物（最大吸收波长为570 nm）： (10.1) 除了(-氨基酸外，其它的氨基酸也可生成有色物质，但无二氧化碳生成，(-，(-，(-和(-氨基酸比(-氨基酸反应慢得多，生成的是蓝色物质，而亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）与茚三酮反应形成黄色化合物（最大吸收波长为440 nm）。氨基酸与茚三酮的反应主要用于柱后衍生，也可用于氨基酸的比色分析，是公认的氨基酸总量的定量方法。在定量分析时，必须除去对测定有干扰的蛋白质、氨和尿素。 邻苯二甲醛（OPA）与巯基试剂，通常与(-巯基乙醇连用，在碱性条件下与第一级氨基酸迅速反应生成1－硫代－2－烷基异吲哚，加成物可产生荧光，在紫外区也有较强的吸收，反应式如下： (10.2) 该反应不仅适用于柱前衍生，也适用于柱后衍生，它既可进行高灵敏度的荧光检测（(ex = 340 nm ，(em = 450 nm），检测限达～mol L-1，也可进行一般的紫外检测（最大吸收波长为230 nm），检测限达5mol L-1。紫外检测的线性范围为10 ~ 200 pmol，荧光为0.8 ~ 15 pmol，OPA本身不干扰分离和检测，不必除去过量试剂，色谱图基线也比较平稳。OPA法主要的缺点是：（1）亚氨基酸不能与其直接反应，需先氧化（如用次氯酸钠）开环后才能反应。（2）荧光产物不稳定。 丹酰氯（Dansyl-Cl）在碱性条件下与氨基酸反应生成强荧光物质，它同一级、二级氨基酸都能起反应，但是反应速率比较慢，在室温条件下需35 min左右，反应产物的转化率与反应时间关系较大，反应温度升高可以加速产物转化，但最高不可超过60℃，否则Dansyl-Cl会发生水解，反而使产物转化率降低。 (10.3) Dansyl-氨基酸在酸性条件下（pH = 2 ~ 3）一般可被乙酸乙酯抽提，大量的Dansyl-Cl的反应副产物Dansyl-OH留在水相，干扰因素减小。但是Dansyl-精氨酸、Dansyl-天冬氨酸、Dansyl-谷氨酸、Dansyl-丝氨酸和Dansyl-苏氨酸则大部分或部分留在水相，往往会被遗漏，而导致错误结论。 Dansyl-Cl法的检测限与OPA法相当，线形范围一般在15 ~ 150 pmol。优点是（1）衍生物比较稳定，一般可放置12 ~ 24 h；（2）Dansyl-Cl胱氨酸衍生物线性关系好，可用于体液中胱氨酸的定量测定。缺点是（1）反应时间必须严格控制；（2）衍生物对紫外光照比较敏感，故反应要在避光条件下进行；（3）易生成多级衍生物，如赖氨酸、组氨酸、色氨酸生成二级衍生物。 异硫氰苯酯（PITC）可以和一级、二级氨基酸反应，在室温条件下仅十分钟即可完成，反应产物具有紫外吸收（最大吸收波长为254 nm）。PITC的衍生物单一、稳定，-20 ℃可贮存数月，4 ℃水溶液可保存3天; 分析时间短,结果准确,紫外检测限可达1 pmol。 (10.4) PITC法最大的缺点就是氨基酸衍生时需要真空干燥以除去过量试剂。 氯甲酸芴甲酯（FMOC-Cl）能与一级、二级氨基酸