多种细胞的培养方法,步骤,心得,经验(大总结).doc

多种细胞的培养方法HePG2细胞和L-02细胞的传代：HePG2细胞属人肝肿瘤的恒生细胞株，L-02细胞则是人胎肝细胞株，二者所使用的培养基可以是一样的，即最常见的DMEM。一干使用低糖的。细胞长满培养瓶时既要传代。使用胰酶消化即可。用D-Hanks液配制成0.25%的胰酶。使用前37度预热，细胞经PBS清洗两遍后，每个中号培养瓶加0.7ml的胰酶，胰酶的量可根据自己培养瓶的大小而定，原则就是能够盖满瓶底。加入胰酶以后，为使酶的活性最大，将培养瓶盖拧紧后放回培养箱中，3分钟左右即用含血清的培养基终止消化。如果在室温情况下消化，时间相应加长，可以在显微镜下观察，当细胞界限已十分清楚，即已分离为单个细胞，且有少量细胞漂起，则要终止消化了。16HBE细胞株的传代方法：镜下观察细胞生长融合达70-80%，准备传代。常规开紫外照射超净台20分钟，同时把含10%胎牛血清的MEM培养基、0。25%胰酶、PBS放置37度培养箱中孵育。20分钟后开始传代。先弃掉旧培养液，加PBS洗一次，然后加0。25%胰酶2ml消化（指25乘25cm大小的培养瓶）细胞，镜下观察细胞，细胞突起回缩，细胞变圆，然后将培养瓶放置37度二氧化碳培养箱中孵育3分钟左右（当然时间是随机的，比如：新配的胰酶作用时间短一些，配制时间长的胰酶作用时间会长一些，当然要不断地镜下观察），待细胞大部分消化下来（大部分细胞呈流沙状脱离瓶壁），加4ml含10%胎牛血清的MEM培养基终止消化。反复吹打瓶壁上残留的细胞，并将已消化下来的细胞吹打均匀，然后吸入离心管中1000转离心1分钟，然后弃掉上清，用手指将离心管中的细胞弹打均匀，加新培养基，吹打均匀，分至3个新的培养瓶中，补足培养液。将培养瓶平放，小心移入37度二氧化碳培养箱中培养过夜。次日观察。胃癌细胞AGS和SGC-7901的培养：细胞传代时不能长的太满,70%-80%就可以传了.实验前先把紫外灯打开照30分钟,然后再把鼓风机开10分钟,同时把培养液和胰酶放入37度水浴箱中,千万记住不要盖上水浴箱的盖子.传代时,我一般把培养瓶口过一下火,就直接把培养液到去,再用0.25%的胰酶(不含EDTA)消化.等细胞变圆,细胞间空隙加大就直接把培养液到去,不用离心,然后再吹打,虽说要轻柔,但很难吹打成单细胞悬液,所以稍用力也没有关系.虽然操作不规范,但节省时间,细胞也没有被污染.AAV-293细胞的传代:AAV-293细胞较喜欢成团生长,比较娇嫩,怕冷,传代时不要一次从二氧化碳培养箱拿出很多瓶,一次只要拿2-3瓶出来传就可以了,否则细胞很容易死掉.细胞在50-60%传代,细胞生长状态最好.用D-Hanks液配制成0.25%的胰酶消化半分钟左右,弃去胰酶.观察培养瓶是否有针孔样缝隙,如有就可以加入培养液吹打细胞.消化过久,对细胞损害很大,而且成团很难吹打成单个细胞.然后加入含有10%小牛血清的DMEM.轻轻放入二氧化碳培养箱中培养.肺癌细胞（人类），其中绝大部分都是贴壁细胞，具体如：（１）　Ａ５４９（肺腺癌）（２）　ＮＣＩＨ４４６（小肺细胞癌）（３）　８０１（非小肺细胞癌）（４）　ＮＣＩＨ４６０　（大细胞肺癌）在消化传代过程中，步骤基本一致：吸去旧的培养液－＞用Ｈａｎｋｓ＇（１Ｘ）清洗一两次－＞加入一定量的消化液（Ｔｒｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ）－＞置显微镜下观察，待细胞大部分变圆时，回到超静台－＞吸去消化液－＞加入一定量的新培养液－＞反复吹打细胞－＞再置显微镜下观察，直到细胞全部悬浮起来－＞吸出一部分加入新的培养瓶中－＞最后再补充加入一定量新的培养液（ＲＰＭＩ１６４０ｗｉｔｈ　１０％　ＦＢＳ）．注意：　吹细胞时尽量多吹边角儿，此处细胞生长的多．另外吸出细胞前要混匀．另注：消化液的配制方法：Trpsin-EDTA(1X)--0.25% Trpsin with EDTA-4Na prepared with 2.5g Trpsin(1:250) and 0.38g EDTA-4Na/L in HBSS小鼠前脂肪细胞（3T3-L1）：吸弃原培养液--PBS洗一两次--加入400ul0.125％胰酶（原代最好加0.05% EDTA）消化--转动培养盘，保证整个盘面都被trypsin液润过-吸弃trypsin后37度消化3min--以完全培液（DMEM+10% FCS＋1/1000Biotin+1/1000泛酸钙--吸打（枪的吸力调至最小），1：10接种，前后左右摇晃培养盘，细胞均匀后放入培养箱继续培养（10%CO2 ,37度）MDBK（牛肾细胞）类型：贴壁细胞来源：购自武汉病毒所细胞保存中心由四川农业大学动物生物技术中心繁殖保存传代步骤：弃去旧的生长液--用无钙镁水(CMF)冲洗贴壁细胞数次(视细胞瓶的大小,3--5次)-