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AGR2、Lgr5在结直肠癌中表达及其临床价值分析 　 .Zyd558 { display:none; } 　近年来我国结直肠癌（colorectal cancer，CRC）发病和死亡呈逐年上升趋势[1]，发病率和死亡率明显高于世界平均水平[2]。目前从分子水平上探索CRC的发生机制、侵袭转移的分子基础已成为CRC研究的热点。人前梯度蛋白AGR2（Anterior Gradient-2，Agr2）作为人类早期阶段前后位分化的相关蛋白，是来源于非洲爪蟾蛋白XAG2的人型同系物[3]。众多研究表明，AGR2与多种肿瘤的生成和转移具有密切关系，关于AGR2对肿瘤的调控作用和机制， 已成为目前肿瘤研究领域的又一重要热点[4]。富含亮氨酸的G蛋白偶联受体（leucine-rich repeat-containing G-protein-coupled receptor 5， Lgr5）作为Wnt通路的目标基因，结合R-脊椎蛋白能够使Wnt/beta;-catenin信号增强， 从而参与了结肠癌等肿瘤的发生[5]。最近研究还发现[6，7]，Lgr5+干细胞可能是CRC起始细胞，并与CRC的转移、复发以及患者的预后密切相关。本研究采用免疫组化方法检测AGR2、Lgr5在CRC及癌旁正常组织中的表达情况，旨在探讨AGR2、Lgr5在CRC发生发展过程中的作用，初步评价二者联合检测对CRC临床病理诊断的意义，为CRC的分子诊断和治疗提供理论依据。 　1资料与方法 　1.1一般资料 　收集山西医科大学第一临床医院病理科2010年1月～2011年12月间CRC患者的石蜡标本70例，同时对标本的临床病理参数进行分析，其中男28例， 女42例， 年龄29～82岁，平均年龄63.7岁；病理分型中高分化17例， 中分化38例，低分化15例；浸润未及浆膜29例，浸润至浆膜层和浆膜层外41例；无淋巴结转移者39例， 有淋巴结转移者31例。癌旁组织20例，取自上述CRC标本肿块边缘距肿块5 cm或以上正常结直肠黏膜组织石蜡标本，均经病理证实无癌浸润，其中男8例，女12例，年龄31～59岁，平均年龄45.7岁。所有CRC患者术前3个月均未行化疗或放疗检查，且除外其他消化道疾病和其他器官肿瘤病史。 毕业论文 http://www.Lw54.coM 　1.2 试剂 　兔抗人AGR2蛋白多克隆抗体购自美国的Proteintech Group Inc公司，兔抗人Lgr5单克隆抗体为Dako公司产品，SABC免疫组化试剂盒及DAB显色剂均购自武汉博士德生物公司。 　1.3 方法 　采用免疫组化SABC法。实验步骤按照试剂盒说明进行，切片常规脱蜡至水，枸橼酸盐高温高压修复抗原，一抗AGR2多克隆兔抗，稀释比例为1∶300，37℃孵育1h；一抗Lgr5单克隆抗体，稀释比例为1∶400，4℃过夜孵育。使用DAB显色，应用苏木精对比染色，最后显微镜下观察染色结果。 　1.4 结果判定标准 　AGR2蛋白染色以细胞质出现黄色或棕黄色颗粒为阳性细胞。染色评分标准按照着色强度及着色细胞数综合计算，并参照许良中和杨文涛的方法判定结果[8]。每张切片阳性细胞的染色强度按无色、浅黄色、黄色、棕黄色分别计为0、1、2、3分；阳性细胞数计分：无阳性细胞为0分、1%～10%为1分、11%～50%为2分、51%～80%为3分、ge;81%为4分；以上两项的乘积0～3分为阴性，4分及以上均为阳性。（4～5分为轻度阳性，6～9分为中度阳性，10分以上为强阳性）。Lgr5蛋白染色以细胞膜和细胞质呈棕黄色颗粒为阳性。在每张切片中随机选取5个高倍镜视野（times;200），其中每视野以200个肿瘤细胞计数，最后以阳性细胞占总细胞数百分数lt;10%的判为染色阴性。 开题报告 http://www.lW54.com/html/lunwenzhiDao/kaitibaogao/ 　1.5统计学处理 　所有数据均应用 SPSS 17.0 软件包进行统计学处理。计数资料采用相对数表示，样本率之间比较用chi;2 检验或 Fishers精确概率法。P﹤0.05为差异有统计学意义。 　2 结果 　2.1 AGR2蛋白免疫组化检测结果 　2.1.1 AGR2蛋白的表达和分布 AGR2染色主要定位于细胞质，呈黄色或棕黄色。AGR2在癌旁正常组织细胞中无表达或弱阳性表达，见封三图1 A；在CRC肿瘤细胞呈阳性（见封三图1B）或强阳性表达（见封三图1 C、D），染色分布呈异质性，表现为片状、灶状或散在分布，肿瘤细胞间质无着色。AGR2在CRC组织的阳性表达率（48/70，68.57%）明显高于在癌旁正常组织的阳性表达率（5/20，25.00%），两者差异有统计学意义（chi;2=12.198，P﹤