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hTERT短发夹状RNA抑制前列腺癌细胞生长探究 　 作者：平浩， 张军晖，陈晓春， 鲁功成 【摘要】 目的 研究靶向端粒酶逆转录酶（hTERT）的短发夹状RNA（shRNA）基因转染对前列腺癌细胞体外生长的抑制效应及其促细胞凋亡作用。 方法 在脂质体介导下将针对hTERT 基因的shRNA表达载体psilencerTRT转染前列腺癌细胞PC3m，得到稳定细胞株PC3m/shRNATRT。采用RTPCR检测hTERT基因表达情况，western blot分析各组细胞hTERT及cmyc蛋白表达变化，细胞计数并绘制细胞生长曲线，Hoechst33258染色、透射电镜、流式细胞仪检测细胞凋亡情况。 结果 重组质粒psilencerTRT转录生成的shRNA使实验组细胞的hTERT基因表达显著下调，抑制率约为89.02%；同时实验组细胞hTERT及cmyc蛋白水平较对照组有明显下降，细胞的生长增殖能力也显著降低（Plt;0.05），生长速率明显变慢，部分细胞呈现凋亡形态学改变，凋亡率为(19.69±4.75)％。 结论 hTERT短发夹状RNA能有效抑制前列腺癌细胞中hTERT表达及癌细胞生长，诱导PC3m细胞凋亡，可望为前列腺癌的基因治疗提供新方法。 【关键词】 端粒酶逆转录酶； 短发夹状RNA； 前列腺癌； 凋亡 RNA干扰是近几年发现和发展起来的一项新的基因阻断技术，由于其具有高效的抑制作用，已广泛应用于医学的多个领域[1]。人端粒酶逆转录酶基因编码的端粒酶催化亚单位在大多数肿瘤中表达上调并对肿瘤细胞的端粒酶活性起重要调控作用，是目前肿瘤基因治疗中一个极具前景的靶点[2]。因此，本研究拟通过转染针对端粒酶hTERT的siRNA表达载体，使其在前列腺癌细胞PC3m内稳定产生特异性的短发夹状RNA(short hairpin RNA, shRNA)，诱导RNA干扰，并探讨shRNA对hTERT、cmyc 表达及细胞增殖和凋亡的影响，寻找新的前列腺癌基因治疗方法。 1 材料和方法 1.1 材料与试剂 质粒psilencer2.1U6neo购自美国Ambion公司。AnnexinⅤFITC试剂盒购自晶美生物技术有限公司。 1.2 shRNA表达载体的构建及鉴定 本实验应用本组已成功构建的重组质粒psilencerTRT[3]，其合成步骤大致如下：针对hTERT基因靶点（TTTCATCAGCAAGTTTGGA）合成两条寡核苷酸链，它包括两端的BamHI和HindIII酶切位点及反向的两个一致的靶序列，被9bp的非同源序列的环间隔，3末端加有TTTTTT终止序列。该正反两条寡核苷酸链退火得到双链DNA，并将该退火siRNA目的片段插入到psilencer2.1U6载体中，连接产物psilencerTRT转化宿主菌DH5α并行测序鉴定；阴性对照质粒psilencerNC由人和鼠的非同源性靶序列构建合成。 1.3 细胞培养及稳定转染 人前列腺癌细胞株PC3m接种于6孔板，在含10%小牛血清的DMEM培养基中生长至50%～70%融合。采用脂质体转染法稳定转染抑制质粒psilencerTRT和对照质粒psilencerNC，按照转染试剂盒说明书提供的步骤进行，将重组质粒与脂质体1∶3混合，G418筛选阳性细胞克隆并进行实验分组，转染psilencerTRT质粒的PC3m细胞命名为PC3m/shRNATRT（实验组），转染psilencerNC质粒的PC3m细胞命名为PC3m/shRNANC（阴性对照组）。未转染质粒的亲本细胞PC3m作为空白对照组。 1.4 RTPCR检测hTERT mRNA的表达水平 收集细胞，提取细胞总RNA，MMLV逆转录酶进行反转录，相应PCR反应体系中进行扩增， PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，紫外线透射仪下观察拍照并行条带灰度分析，hTERT与βactin灰度的比值即为hTERT mRNA相对量A值。 抑制率＝A实验组/A阴性对照组×100% 1.5 Western blot检测hTERT、cmyc蛋白表达 收集细胞后加入预冷的裂解缓冲液，离心取上清，二喹啉甲酸法测定蛋白含量。以等量蛋白上样，在聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，电转移法将蛋白质从SDSPAGE凝胶转移至聚偏二氟乙烯膜，室温封闭，并分别加入一抗及二抗，碱性磷酸酶系统显色，同时βactin蛋白作为内参照。 1.6 细胞生长曲线测定 将PC3m细胞及稳定表达G418抗性的转染细胞以1×104/ml的浓度接种于24孔板中，每隔24h对每组细胞的3个孔进行消化，显微镜下计数，取平均值，共测5个时间点，以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，绘制生长曲线。 1.7