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KSHV RTA上调宿主细胞Bcl—2表达分子方式分析
KSHV RTA上调宿主细胞Bcl—2表达分子方式分析
[摘要] 目的 研究卡波氏肉瘤病毒(Kaposis’s Sarcoma-Associated Herpesvirus,KSHV)编码的复制转录激活因子(replication and transcription activator,RTA)调控宿主细胞Bcl-2表达的分子机制。 方法 用实时聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质印迹(Western blot)技术检测RTA转染的细胞、TPA诱导的KSHV阳性细胞Bcl-2 mRNA和蛋白质表达水平;采用PCR定点突变和荧光素酶报告基因技术,检测RTA对Bcl-2基因启动子活性的调节,并鉴定启动子序列中对RTA调控具有重要作用的顺式反应元件。 结果 RTA转染的细胞、TPA诱导的KSHV阳性细胞Bcl-2 mRNA和蛋白质表达水平显著增高。RTA通过与Bcl-2基因启动子中CCN9GG反应元件结合激活Bcl-2的转录,这种激活作用呈剂量依赖性,并且P2启动子对RTA反式激活Bcl-2基因不可或缺。 结论 KSHV RTA能够上调宿主细胞Bcl-2表达,CCN9GG样RTA反应元件和P2启动子对RTA调控Bcl-2表达具有重要作用。
[关键词] 卡波氏肉瘤病毒;复制转录激活因子;Bcl-2;表达上调;启动子活性
[中图分类号] R392.1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2012)10(c)-0012-04
卡波氏肉瘤病毒(Kaposis’s Sarcoma-Associated Herpesvirus,KSHV)发现于1994年,又称gamma;-疱疹病毒8型。该病毒是卡波氏肉瘤(Kaposis’s Sarcoma)、原发性渗出性淋巴瘤(primary effusion lymphoa,PEL)、多中心卡氏病(multicentric Castleman’s diease)的病原体[1]。KSHV病毒基因组呈双链DNA,有两种不同的生活周期:潜伏性感染(lantent infection)与裂解性复制(lytic replication)。这两种感染方式存在反馈性调节并可以相互转化[2-3]。在潜伏性感染时,病毒以游离体的形式存在,只表达ORF73、K12、ORF72、ORF71、K15等少数潜伏性基因,有利于建立持久性的感染[4]。在缺氧或TPA诱导等因素作用下病毒呈裂解性感染,以级联反应的形式激活一系列病毒编码基因,并导致宿主细胞的死亡及病毒子的释放,传播至新的宿主细胞[5-6]。
KSHV复制转录激活因子(replication and transcription activator,RTA)是ORF50编码的一种即刻早期蛋白,是促使病毒从潜伏性感染向裂解性感染转变的关键调控因子。无论是外源性还是内源性来源引起的RTA表达增高,均可介导病毒裂解性基因的级联表达[7]。一些化学物质如TPA、butyrate等可诱导KSHV的溶解性感染[8]。KSHV阳性细胞经TPA诱导后1 h就可检出RTA的表达[9]。通过Blast比对,笔者发现抗凋亡基因Bcl-2的P1启动子上游区域含有9个CCN9GG样序列,这里N可以为任何碱基。这些CCN9GG样序列为近年来新发现的RTA反应元件(RTA responsive elements,RREs)[10]。KSHV RTA能否与这些RRE相互作用并调节宿主细胞Bcl-2基因表达?这引起了研究者的极大兴趣。本研究主要探讨KSHV RTA上调宿主Bcl-2的分子机制。
1 材料与方法
1.1 质粒
pcDNA-RTA编码全长RTA的真核表达载体。pGL3-Bcl-2为含Bcl-2基因全长启动子的荧光素酶报告质粒。pGL3-△RREs,pGL3-△P1,pGL3-△P2是采用PCR定点突变技术构建的报告质粒(引物见表1),它们分别突变了Bcl-2基因全长启动子中的9个RRE、启动子P1与启动子P2。构建pGL3-△RREs时,将PCR扩增片段(Bcl-2启动子核苷酸-1563~+1)插入pGL3载体SmaI/HindⅢ双酶切位点处;构建pGL3-△P2时,将启动子片段(-2744~-680)插入pGL3载体SmaI/HindⅢ双酶切位点处;构建pGL3-△P1时,先将启动子片段(-346~+1)插入pGL3载体MluI/HindⅢ双酶切位点处(pGL3-P2),再将片段(核苷酸-2867~-1545)插入pGL3-P2的MluI/HindⅢ双酶切位点处。
1.2 抗体与细胞
RTA抗体用杂交瘤技术制备,由上海巴斯德研究所蓝柯实验室提供。Bcl-2小鼠单克隆抗体购自Santa Cruz公司,GAPDH抗体为Novus Biologicals公司
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