植物次生代谢物的细胞培养技术研究.doc

植物次生代谢物的细胞培养技术研究进展 摘要: 近年来, 植物的次生代谢物的结构、功能与应用越来越受人们的关注。为了既能满足人们对植物次生代谢物的需求, 又能合理开发利用自然植物资源和保护生态环境, 植物细胞培养成为生产植物次生代谢物的关键技术。本文重点阐述了 6 种植物细胞培养技术和植物细胞培养生产植物次生代谢物过程中的重要影响因素及其调控, 同时对前述两个方面的深入研究提出了合理化建议。 关键词: 植物次生代谢物; 细胞培养技术; 植物次生代谢产物利用可追溯到远古时代, 迄今为止这些天然产物仍在人类的生活中占有重要的位置。但从天然或栽培植物中提取植物次生代谢产物受到以下因素制约: 野生资源的盲目采集, 易造成许多野生植物趋于濒危和生态环境的破坏; 生态环境的差异, 产生的引种和驯化很困难; 可耕地面积日益减少; 栽培过程的自然环境影响, 使产量和质量难以控制。而化学合成方法由于工艺复杂, 费用高, 易造成新的环境污染, 其发展也不受欢迎。自从 Routine和 Nickel(1956)首次提出用植物细胞培养技术生产有用次级代谢产物以来, 据不完全统计应用于植物细胞培养技术生产次生代谢产物的植物已达百种以上, 近半数的次生代谢产物含量超过原植株。目前植物次生代谢产物的生产在药物如紫杉醇、长春碱等; 油料如豆寇油、春黄菊油等; 食品添加剂如生姜、香子兰等; 调味剂如胡椒、留兰香等; 饮料如 咖啡、可可等; 树胶如阿拉伯胶等。由于植物细胞培养生产有用代谢产物可(1)在完全人工控制的条件下一年四季不断进行生产, 不受地区和季节限制, 节约土地, 较便于工业化生产; (2) 通过改变培养条件和选择优良系的方法得到超越原植物产量的代谢物, 例如通过新疆紫草的细胞培养获得了比原植株含量高 6 倍的紫草素; (3)在无菌条件下完成的,能排除病菌及虫害对药用植物的侵扰; (4) 对有效成分的合成路线进行遗传操作, 以提高所需的次生代谢产物含量, 也可以进行特定的生物转化反应, 大规模生产我们所需的有效次生代谢产物; (5) 作为解决资源问题的较为有效的途径而成为当代生物技术的重要发展领域, 吸引了众多国家实验室和研究人员, 也取得了可喜的进展, 但真正实现植物次生物大规模生产仍有许多问题有待解决, 本文就植物细胞培养技术中的若干重要问题进行探讨, 以期推动我国植物细胞培养技术的发展和满足人们对植物次生代谢物的日益增长的需求。 1 植物细胞培养技术 1.1 固定化培养技术 自 1979 年 Brodelius 等人利用固定化培养技术用于生产植物次生代谢物以来, 已有 10 多种植物细胞应用成功。由于固定化培养与悬浮培养相比, 具有: (1)可极大限度地减少剪切力的损伤作用, 便于连续培养和延长植物细胞寿命以及提高培养细胞的利用率; (2)固定化培养的植物细胞生长相对缓慢, 有利于植物次生代谢物的积累; (3)固定化培养的植物细胞的培养密度高, 可提高产植物次生代谢物的产量; (4)固定化培养生产的植物次生代谢物直接分泌到培养液中, 可简化分离步骤提高工作效率等方面的优点而应用于植物次生代谢物的生产。此项技术的改进与完善主要有(1)包埋物的多样化: 已由原来单一的海藻酸拓展为海藻酸、琼脂糖、琼脂、角叉菜聚糖, 且取得良好的效果, 如固定化的长春花细胞生产阿玛碱的产量分别达到游离细胞的 176%、114%、95%和 84%。(2)固定方法上已采用吸附固定、共价结合固定、网格及泡沫固定、膜固定( 包括中空纤维) 植物细胞的方法。由于植物次生代谢物的释放并非都以分泌的方式而使该项技术的应用受到一定限制, 同时固定化的植物细胞氧、养分的供应与传递以及细胞的遗传稳定性等问题有待于进一步研究解决。 1.2 两相培养技术 在培养体系中加入水溶性或脂溶性有机物或者具有吸附作用的多聚物使培养体系分为上下两相, 细胞或组织在水相中生长和合成次生代谢物质, 次生代谢物质分泌出后再转移到有机相中, 然后再从有机相分离植物次生代谢物的技术, 称为两相培养技术。迄今为止, 已有 18 种植物细胞应用此项技术获得成功。例如在紫草悬浮系培养中在合适时间添加十六烷提取紫草素, 可使产量提高七倍多; 长春花细胞培养中加入 XAD- 7 大孔吸附树脂, 可使吲哚生物碱含量明显提高; 孔雀草发根培养中添加十六烷, 可使噻吩的分泌量由原来的 l%提高至 30%- 70%[1]。虽然两相培养术可利用有机相及时分离植物细胞或组织产生的次生代谢物, 减少了次生代谢产物的反馈抑制, 同时也提高了次生代谢产物含量, 而且有机相可以循环使用, 基本实现了植物组织的连续培养, 但建立和利用两相培养技术的关键是: (1) 添加的有机相或多聚物对植物组织、细胞无害, 不影响其生长和次生代谢产物合成; (