MTT比色法检测露蜂房蛋白对白血病细胞增殖影响△.docVIP

MTT比色法检测露蜂房蛋白对白血病细胞增殖影响△ 　 作者：张雪莉 张圣明 时彦 王强 苗乃法 【摘要】 　　目的：研究露蜂房蛋白对白血病细胞增殖的影响，为白血病的治疗提供新的药物。方法：制备红白血病小鼠模型，采用MTT法检测露蜂房蛋白对白血病细胞增殖的作用。结果：露蜂房蛋白低浓度处理组与生理盐水组相比无明显差别，中浓度处理组与生理盐水组比较对白血病细胞有抑制作用，两组间具有统计学意义，与化疗药物(柔红霉素)相比还有差距。结论：露蜂房蛋白对白血病细胞具有抑制增殖的功效。 【关键词】 MTT比色法 露蜂房 蛋白 增殖 　　据医籍记载，露蜂房具有祛风、攻毒、杀虫等功效。其成分较为复杂，目前研究较多的是蜂胶，对其蛋白成分的研究报道甚少。本实验采用MTT法观察露蜂房蛋白对红白血病细胞增殖的影响。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 MTT：购于美国Sigma 公司；三联溶解液：SDS 异丁醇 盐酸；RPMI1640：美国Gibco产品；新生牛血清：杭州江滨生物技术有限公司；二甲基亚砜（DMSO）：美国Sigma产品。 　　1.1.2 仪器 酶标仪；二氧化碳培养箱；SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台：苏州。 　　1.1.3 EL9611细胞株：天津血液病研究所；露蜂房蛋白（Nidus vespae Protein, NVP）：自制。 　　1.1.4 动物 健康的BALB/c小鼠30只，6～8周龄，体重为18～22g，雌雄不限。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 红白血病小鼠模型制备的方法［1］： 　　① 将红白血病细胞株用生理盐水洗3次，尾静脉接种给健康的BALB/C小鼠，接种细胞数为2×106/只。 　　② 接种后的小鼠进行动态观察，每隔3天尾静脉取血，涂片，常规瑞氏染色。并注意观察小鼠的表现，如精神状态、毛光泽度等。 　　③ 在外周血中发现有核红细胞则可确定为小鼠白血病模型复制成功，待小鼠濒危时，再取尾静脉血，涂片，常规瑞氏染色。 　　④ 确定小鼠发病后无菌条件下取发病小鼠的脾，置于200目铜滤网上，用针拴轻轻研磨，制成细胞匀浆。 　　⑤ 以生理盐水冲洗滤网，4号针头过滤，使成单细胞悬液。 　　⑥ 调整细胞浓度：胎盘兰染色计数活细胞，活细胞率gt;98%，细胞悬液的浓度为107/ml 。 　　1.2.2 改良MTT比色法检测细胞增殖［2］ 　　① 取发病小鼠的脾细胞悬液，将106～107/ml发病小鼠脾的单细胞悬液按90μl/孔接种于96孔微量培养板内，然后加入药液10μl/孔，设高、中、低3个浓度(每个浓度相差10倍)组，即生理盐水组，柔红霉素阳性对照组，每组设3个复孔。每块板设一个空白调零孔，内加培养液，不含细胞与药物。 　　② 接种完毕后在37℃，5%CO2饱和湿度培养箱内孵育培养72h。 　　③ 加MTT：加MTT溶液10μl/孔，混匀后37℃， 5%CO2饱和湿度培养箱内孵育4h。 　　④ 加溶解液：加三联溶解液100μl/孔，混匀后37℃放置过夜以溶解甲月赞。 　　⑤ 吸光度（OD）测定：用酶标仪测定每孔吸光度，测定波长为450nm。 　　⑥ 肿瘤细胞抑制率的计算： 　　肿瘤细胞抑制率=(对照组OD值-治疗组OD值)/对照组OD值×100%。 　　1.3 统计学处理： 　　用SAS 8.0 统计软件对所获数据进行分析，经检验资料符合正态方差齐条件，故使用方差分析取α=0.05对数据进行检验。 　　　2 结果 　　经方差分析检验可知，Plt;0.0001，在α=0.05水平上，有统计学意义，各处理组间存在差别，可以认为生理盐水、NVP低浓度、中浓度、高浓度及柔红霉素对白血病小鼠脾组织白血病细胞的抑制增殖作用不全相同。经两两比较可知，NVP低浓度处理组肿瘤细胞抑制率为10．3%（表1），经方差分析（表2），在α=0.05水准上，NVP处理组低浓度组和生理盐水对照组没有统计学意义（Pgt;0.05），可以认为NVP低浓度处理组对白血病小鼠脾组织白血病细胞没有明显抑制增殖的作用；中浓度组和高浓度组其肿瘤细胞抑制率分别为42.7%和50.1%，经方差分析可知，在α=0.01水准上，与生理盐水对照相比有显著的统计学意义（Plt;0.01），NVP高浓度处理组和NVP中浓度组之间没有统计学意义（Pgt;0.05），可以认为中浓度组和高浓度组均有显著抑制肿瘤细胞增殖的作用；柔红霉素阳性对照组的抑制率为84.3%，高浓度组与柔红霉素阳性对照组相比仍具有统计学意义（Plt;0.01），可以认为高浓度组与柔红霉素组效果不相同。NVP处理组对肿瘤细胞的增殖具有抑制作用，但药效仍低于柔红霉素阳性对照组对肿瘤细胞的抑制效果。 　　表1 MTT比色法检测NVP对脾