N-乙酰半胱氨酸对急性肺损伤大鼠肺组织水通道蛋白表达探究.docVIP

N-乙酰半胱氨酸对急性肺损伤大鼠肺组织水通道蛋白表达探究 　【摘要】 目的： 观察N-乙酰半胱氨酸(NAC)对急性肺损伤(ALI)肺组织水通道蛋白-1的表达,进一步探讨N-乙酰半胱氨酸对急性肺损伤(ALI)肺组织的保护作用。方法： 应用脂多糖(LPS)诱导大鼠急性肺损伤(ALI)模型,然后应用N-乙酰半胱氨酸进行干预。实验设对照组、模型组、N-乙酰半胱氨酸组，在肺损伤模型成功后24 h处死大鼠,取左叶肺组织。采用免疫组化染色, 检测N-乙酰半胱氨酸对急性肺损伤大鼠肺组织中水通道蛋白-1 (AQP-1)的表达, 利用HPIAS-2000图像分析系统测定水通道蛋白-1在以上各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果： 实验对照组肺组织表达高水平AQP-1；模型组肺组织呈浅黄色染色, AQP-1表达较低；N-乙酰半胱氨酸组肺组织表达高水平AQP-1。经q 检验，实验对照组与模型组之间，AQP-1的平均光密度及阳性面积率有显著性差异(P＜0.01﹚，实验对照组与N-乙酰半胱氨酸组之间，AQP-1的平均光密度及阳性面积率差异无显著性(P＞0.05)。结论： N-乙酰半胱氨酸能使急性肺损伤组织中AQP-1呈高表达，对急性肺损伤组织有重要的保护作用。 【关键词】 N-乙酰半胱氨酸 肺损伤 水通道蛋白-1 　　急性肺损伤(ALI)的显著特征是大量富含蛋白的渗出液流入到肺泡腔,严重影响肺的换气功能,导致低氧血症、呼吸衰竭,病死率高达30%~40%［1］。目前认为,以炎性细胞因子大量释放为特征的过度全身炎症反应是ALI的主要发病基础,并伴有纤维组织增生［2］。但发病机制仍不十分清楚，因此给临床治疗带来诸多问题。 NAC是左旋精氨酸的天然衍生物,是一种含活性巯基化合物［3］。近年国内外大量实验研究结果已经证明,NAC具有强大的抗氧化和细胞保护作用。但有关NAC对急性肺损伤炎性细胞因子影响的研究尚少。我们应用脂多糖(LPS)诱导大鼠急性肺损伤(ALI)模型,然后应用NAC进行干预，观察急性肺损伤大鼠肺组织中水通道蛋白(AQP)的表达, 利用HPIAS-2000图像分析系统测定水通道蛋白-1在以上各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率,进一步探讨NAC在防治急性肺损伤中的作用机制。 　　1 材料和方法 　　1.1 动物模型制备及分组 健康Wistar大鼠60只（雌雄不拘）, 清洁级（SPF），平均体重(180±35)g，由武汉大学实验动物中心提供。试验前禁食12h, 自由饮水。实验分组分为3组：实验设对照组（注射等量生理盐水，n=20）、模型组（经颈外静脉缓慢注射LPS 2.5 mg/kg，n=20)、NAC组（于尾静脉注射LPS前1 h分别经腹腔注射NAC(200 mg/kg)，n=20）。 　　1.2 动物标本制备 将各组动物处死，收集肺组织标本，进行组织学及免疫组织化学标本制作，取材时间为LPS注射后24h(T24)。主要试剂：① 浓缩型兔抗鼠水通道蛋白-1多克隆抗体(武汉博士德生物技术公司)；② 超敏即用型S-P通用型免疫组织化学试剂盒（福州迈新生物有限公司）；③ 显色试盒及多聚赖氨酸（北京中山生物技术有限公司）。 　　1.2 主要仪器 　　YWY781型医用微波仪（250 W，50 Hz），浙江临安电子器材厂生产；家用高压锅。 　　1.3 方法 　　1.3.1 常规HE染色 　　取材、固定、脱水、透明、切片和HE染色。 　　1.3.2 免疫组织化学S-P法检测AQP-1相关抗原 主要步骤： ① 组织切片5μm，常规脱蜡至水，蒸馏水洗； ② 3%过氧化氢，37℃孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗4×5min； ③ AQP-1采用微波抗原修复（3档，10 min），采用高压抗原修复PBS洗4×5min； ④ 正常羊血清37℃孵育10 min以减少非特异性反应； ⑤ 一抗37℃孵育1 h，PBS洗4×5min； ⑥ 生物素标记的二抗，37℃孵育10 min，PBS洗4×5min； ⑦ 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物37℃孵育10 min，PBS洗4×5min； ⑧ DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应； ⑨ 苏木精复染，脱水，透明，封片。 用PBS代替一抗作为阴性对照。 　　1.3.3 免疫组织化学结果判断 　　AQP-1相关抗原以细胞质出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照除细胞核染成蓝色外，胞核和胞浆内无棕黄色反应物。 　　采用HPIAS-2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统（同济千屏影像公司）对AQP-1的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定AQP-1每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。