TGF-β2刺激人Tenon囊成纤维细胞增殖，表达CTGF及合成Fn.docVIP

TGF-β2刺激人Tenon囊成纤维细胞增殖，表达CTGF及合成Fn 　【摘要】 目的：研究转化生长因子（TGF-β2）和结缔组织生长因子(CTGF)在滤过泡瘢痕化中的作用。 方法：用不同浓度的TGF-β2刺激HTF，然后用RT-PCR和免疫细胞化学法分别检测CTGF和Fn的表达，用MTT法检测细胞的增殖。 结果：TGF-β2 2μg/L到5μg/L范围有剂量依赖性地促进HTF的细胞增殖，CTGF的表达和Fn的合成的趋势(P lt;0.01),但0.5μg/L，1μg/L与正常对照组对细胞的增殖作用差别无显著性，5μg/L与10μg/L增强细胞的增殖作用也无显著性差异（P gt;0.05）。 结论：TGF-β2能够明显地促进HTF细胞增殖，并增强其下游介质（CTGF）的表达和合成细胞外基质-纤维连接蛋白（fibronetin, Fn）。 【关键词】 结缔组织生长因子 转化生长因子-β2 纤维连接蛋白 Tenon囊成纤维细胞 青光眼滤过术 0引言 青光眼滤过术后滤过泡的瘢痕化是手术失败的关键原因，滤过泡瘢痕形成机制涉及很多生长因子，有研究表明与滤过手术联系最密切的则为转化生长因子TGF-β2[1]。结缔组织生长因子（CTGF）是继TGF-β之后发现的又一个重要的促纤维化因子，被认为是TGF-β的下游作用元件以及纤维化进程的启动因子[2]，其作用主要表现为促进细胞有丝分裂和增生、趋化细胞、诱导细胞粘附、促进细胞外基质(ECM)的合成[3]，针对CTGF的治疗有可能开辟一条仅特异作用于TGF-β引起的纤维化而不影响其他免疫活性作用发挥的新途径。有研究证实，TGF-β2能够刺激HTF产生CTGF[4]，但TGF-β2是否也具有相同的作用，这点在人体滤过泡的瘢痕化中仍未得到证实，因此，我们设计不同浓度的TGF-β2刺激的HTF细胞，看其是否能促进细胞的增殖，表达CTGF以及合成Fn，初步探讨CTGF在滤过泡瘢痕化中可能的作用。 1材料和方法 1.1材料 人重组TGF-β2蛋白（Peprotech，USA），鼠抗人Fn抗体（Santa cruz，USA），SP试剂盒（北京中杉），DAB试剂盒(武汉博士德)，羊抗人多克隆CTGF抗体（Ramp;D,USA），羊抗兔二抗（武汉博士德），二甲基四氮唑盐（MTT）（Sigma，USA），二甲基亚砜（DMSO）（Sigma，USA），Trizol Reagent (Invitrogen, USA)，逆转录及PCR试剂盒(Progrema,USA)。以青光眼滤过术中取下的人Tenon囊筋膜组织,采用组织块贴壁培养法[5]培养人Tenon囊成纤维细胞。取3～6代对数生长期HTF进行实验。 1.2方法 消化80%融合的细胞后，用含150g/L新生牛血清的DMEM培养液调成5×107/L细胞悬液，按100μL/孔接种于96孔板，24h后吸除培养液，分为空白对照组（无血清DMEM培养液）和6个处理组：分别为不同浓度的TGF-β2（0.5，1，2，4，5，10μg/L），诱导培养24h，每组设8个复孔。24h后加入MTT 20μL/孔，继续在CO2培养箱中培养4h后，弃去培养液，加入DMSO 150μL/孔，静置30min，在酶联免疫测定仪上测其在570/630nm处的吸光度值（A）。实验重复3次。另将细胞悬液1×108/L密度接种于放有盖玻片的6孔板中,贴壁24h后选用3个TGF-β2浓度组（T1 2μg/L，T2 4μg/L ，T3 5μg/L）及正常对照组（N组）（每组4片）分别加入各自不同的培养液共3mL，诱导24h后终止培养，用4℃ PBS漂洗3次，再放入4℃固定液（冷丙酮：无水乙醇＝1∶1的混合液）中固定15min，晾干后再按S-P法即用型试剂盒和DAB试剂盒说明书操作，鼠抗人Fn多克隆抗体稀释度1∶100，DAB显色2min，苏木素复染。PBS代替一抗作阴性对照。将每张片图像摄入计算机，通过HMIAS-2000高清晰度彩色医学图像分析系统，得出代表每张爬片阳性表达强弱的平均灰密度值（A），然后再进行统计学处理。实验重复3次。另收集各组（实验分组同上：T1，T2，T3，N共4组）培养瓶中的HTF，用Trizol Reagent裂解细胞，提取总RNA，于波长260，280nm处测定吸光度（A）值。逆转录反应条件为42℃ 1h，99℃ 5min，5℃ 5min，同时设无RNA的阴性对照。PCR反应引物设计应用Primer Premier 5.0软件，其内参照为β-actin。预期CTGF的扩增片断长度为292bp，上游引物为5′-TCTTCGGTGGTACGGTGTA -3′,下游引物为5′-ACCAGGCAGTTGGCTCTAA-3′;β-actin扩增片段长度为283bp,上游引物为5′