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一种用于生物芯片标记效率探究方法 　 作者：王治伟，马文丽，夏巍，杨琼，郑文岭【摘要】 目的 利用自杂交的方法对芯片杂交样品的标记效率进行检测和实验质控。方法 提取人红白血病K562细胞RNA后，将核酸样品等分成两等份，分别应用通用引物标记Cy3和Cy5荧光物质，然后和制备的K562芯片进行杂交，通过比较杂交后探针上Cy3和Cy5的荧光信号强度，对样品的标记效率和杂交流程进行实验分析和质控。结果 杂交后的芯片探针显示为等量的Cy3和Cy5重叠后的黄色荧光，由于样品是等量的同一种核酸物质，从而证明了样品标记的效率一致性较好。结论 通过自身杂交方法来比较相同样品两种荧光标记物的信号强度，对芯片本身的质量进行检测，分析标记物的标记效率，可以应用于生物芯片实验的质量控制。 【关键词】 生物芯片;标记;杂交 　　Abstract:Objective To investigate the effect of selfhybridization method of analyzing samples labeling for microarray experiment. Methods The total RNAs were extracted and purified from K562 cells to synthesize doublestranded cDNAs by reverse transcription. Then two homologous samples were labeled with two different fluorescent dyes Cy3 and Cy5. And the labeled samples were examined with the printed microarray. Results With the same quantity of fluorescence Cy3 and Cy5 overlap, the microarray image showed almost yellow color. And the selfhybridization method could be used to control the fluorescence quality. Conclusion The method that used selfhybridization method to obtain quality data set from a microarray experiment for assessment of the microarray and labeled samples quality can be used in quality control of microarray experiment. 　　Key words:microarray; label; hybridization 　　生物芯片实验是一个多阶段的实验流程，包括了从芯片的打印制备、样品的分离提取、荧光物质的标记、芯片的杂交和扫描等［1］。在实验中常常由于标记效率的差异影响实验结果，特别是表达谱芯片中两种样品的竞争性杂交，标记效率的不同会直接影响差异表达基因的分析。目前对于芯片的样品标记，结合统计学提出了很多实验后数据分析方法，但是从整体实验设计对样品标记效率直接分析，来对实验过程进行质量控制，还未见报道［2，3］。本研究采用自身杂交的方法，将同样的实验样品分别用不同荧光物质标记后和芯片进行杂交，通过比较两种荧光物质的信号强度，对样品的标记效率进行评估和研究，从而为进一步应用基因芯片技术提供更好的途径。 　　1 材料与方法 　　1．1 材料 人红白血病K562细胞株由广州军区总医院医学实验科提供；总RNA提取试剂（Trizol）及PCR产物纯化试剂盒购自上海博彩生物工程公司；mRNA纯化试剂、荧光染料Cy3、Cy5 dUTP购自Pharmacia公司；限制性内切酶Sau3AⅠ、Taq酶、T4DNA连接酶、Rnase H等购自Takara生物技术公司；CMTGAPS表面氨基化玻片购自Corning公司；DMSO及Formamide购自Amresco公司。 　　1．2 细胞培养 K562细胞常规培养（37 ℃，5% CO2）于含10%（φ）的精制小牛血清和青霉素、链霉素各100 u/mL的RPMI1640培养基中。 　　1.3 靶基因片段的制备 应用RDPCR技术构建K562细胞正常状态下的cDNA片段文库［4］，从中选择克隆扩增。PCR产物经纯化后，紫外分光光度计DU530测定浓度，用DMSO调整浓度为0.5 mg/mL，加样至384孔板中备用。 　　1.4 芯片的制备