一起流脑死亡患者密切接触者咽部带菌调查.docVIP

一起流脑死亡患者密切接触者咽部带菌调查 　摘　要：对流脑死亡患者的密切接触者进行咽部带菌调查，为做好流脑防制工作及时提供科学依据。方法：采用常规的病原分离法和PCR法对密切接触者的咽拭标本进行检测。结果：19例密切接触者的咽拭标本经常规的病原分离法检出3株C群脑膜炎奈瑟菌，通过PCR方法检出4份标本含有脑膜炎奈瑟菌C群特异性核酸片段。结论：1例流脑死亡病例系由C群脑膜炎奈瑟菌所致。PCR法在流脑实验室诊断中其阳性率比常规的病原分离方法高。 关键词：流行性脑脊髓膜炎；密切接触者；细菌培养；PCR 　　2010年2月22日，上饶市疾控中心接到疫情报告，在弋阳县人民医院发现1例疑似流脑患儿，该患儿2010年2月20日出现高热、全身疼痛，家长以为普通感冒，让患儿在家服药休息。2010年2月22日因高烧不退，于当天上午9：30时入院，入院时体温39.3℃，出现意识障碍，颈项强直，皮肤出血点较多。血常规结果：白血球总数6.2×109个/L，中性粒细胞82.2%，脑脊液涂片查到G－双球菌。中午12：00时患者病情加重，立即转院南昌，经抢救无效当晚死亡。临床诊断该患儿为流行性脑脊髓膜炎。上饶市疾控人员立即对本起疫情进行流行病学调查，并前往弋阳县港口潘家村采集该死亡患儿19例密切接触同学的咽拭标本，带回实验室进行微生物学检验。 　1 资料与方法 　1.1 一般资料：标本来源：用无菌“7”形棉拭子采集与死亡患儿密切接触同学的咽拭标本19份。试剂与培养基：含抗生素卵黄双抗平板、卵黄琼脂平板、革兰染液、触酶试剂、氧化酶试纸均为青岛海博生物技术有限公司产品，PCR相关试剂盒为上海宝生科技发展有限公司产品。以上试剂均在有效期内使用。 　1.2 诊断血清：脑膜炎奈瑟菌诊断血清为中国药品生物制品检定所提供。 　1.3 主要仪器：PCR扩增仪（MJ）、自动凝胶成像仪（UVP）、电泳仪。 　1.4 方法：依照《流行性脑脊髓膜炎诊断标准和处理原则》GB16884-1997方法进行；PCR检测按常规PCR检测方法进行。 　2 病原学检测 　2.1 分离培养：用无菌“7”形棉拭子采集19例密切接触者咽部分泌物，立即接种卵黄双抗琼脂平板，烛缸保温运送。到实验室后放置于含5%～10% CO2环境中，35℃，培养24 h观察结果。在其中3块卵黄双抗琼脂平板上生长可疑菌落，菌落较大、圆形、无色、湿润。 　2.2 纯培养：将3份可疑菌落接种于未加抗生素的卵黄琼脂平板上，置于含5%～10% CO2环境中，35℃培养24 h。 　2.3 氧化酶、触酶试验：挑取3份可疑标本进行氧化酶、触酶试验，结果均为阳性（+）。 　2.4 糖类发酵试验：挑取3份可疑标本进行糖类发酵试验，结果为：葡萄糖、麦芽糖均产酸不产气， 蔗糖、乳糖、果糖均为阴性。 　2.5 革兰染色镜检：挑取3份可疑菌落进行革兰染色镜检，结果均为肾形排列，凹面相对，革兰阴性双球菌。 　2.6 血清学：3份可疑标本血清学结果相同均为：多价Ⅰ（+）、多价Ⅱ（-）、多价Ⅲ（-）、A群（-）、B群（-）、C群（+）、盐水凝集（-）。 　3 PCR方法 　3.1 样本处理：咽拭、脑脊液标本处理：取咽拭标本增菌液100 μl（脑脊液取1 ml）于EP离心管中，12 000r/min离心5 min，弃上清液，在沉淀中加100 μl裂解液，振荡混匀置100℃水浴10～15 min；12 000 r/min离心10 min，保留上清液待用。 　3.2 试剂配制：从试剂盒中取出PCR反应液、Taq酶，室温融化后。2 000 r/min离心10 s。设置需要的管数n（n=样本数+1管阳性对照+1管阴性对照），反应体系试剂配制：PCR反应液20 μl，Taq酶1 μl。在适当体积离心管中加入计算好的各试剂使用量，充分混匀，另取n个PCR反应管，分别加入21 μl混匀好的试剂。 　3.3 加样：在设定的n个PCR反应管中分别加入处理过的样本、阳性对照、阴性对照（去离子水）3 μl，震荡混匀，于2 000 r/min离心5 s，将PCR反应管放入PCR仪中。 　3.4 PCR扩增循环条件：首先预变性94℃ 5 min，然后94 ℃ 35 s、55℃ 35 s、72℃ 70 s，循环35次，最后72℃延长3 min。 　3.5 配制琼脂糖进行点样：接通电源，电泳开始，电泳时间需30 min。 　3.6 结果判断：在自动凝胶成像仪中读取数据。与阳性对照同一水平线出现的条带为阳性，未出现条带则为阴性。目的片断：流脑通用410 bp，A群400 bp，B群450 bp，C群250 bp。见图1。 　1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 　　注：1、9、17：DL2000 DNA Mark