三叶青提取物对人结肠癌细胞系RKO细胞凋亡影响.docVIP

三叶青提取物对人结肠癌细胞系RKO细胞凋亡影响 　【摘要】 观察三叶青提取物对人结肠癌细胞系RKO细胞凋亡的作用，初步探讨其可能的机制。［方法］采用体外细胞培养技术，用MTT法观察三叶青提取物RKO细胞的影响；琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡；RTPCR检测Bid，Bax，Bcl2和BclXL的表达改变。［结果］三叶青提取物能显著地抑制人结肠癌细胞系RKO细胞的生长，并且具有浓度依赖性，且细胞有明显的凋亡特征性改变，并能下调BclXL、上调Bid来诱导凋亡。［结论］三叶青提取物具有对人结肠癌细胞系RKO细胞抗增殖和诱导凋亡的作用，且呈剂量依赖性。 【关键词】 三叶青提取物 RKO细胞 凋亡 　　Abstract: ［Objective］ To observe clover extracts effect on human colon cancer PKO cellular apoptosis, primarily explore its possible mechanism. ［Method］ Take cell culture in vitro and MTT technology to observe clover extracts influence on PKO cell, test apoptosis with agarose gel electrophoresis, test the changes of Bid, Bax, Bcl2 and BclXL with PTPCR. ［Result］ Clover extract can markedly inhibit PKO growth, with dependence of concentration and obvious apoptosis change, also can downregulate BclXL, upregulate Bid to cause apoptosis. ［Conclusion］ Clover extract has antihyperplasia and induces apoptosis to human colon cancer cellular PKO, in dependence of concentration. 　　Key words: clover extract; PKO cell; apoptosis 　　以往研究发现三叶青活性成分对体外培养的人结肠癌细胞系RKO具有显著的细胞毒作用，并表现为凋亡特征。为使三叶青在结肠癌临床治疗方面提供理论依据，而进一步做此研究。 　　1 材料和方法 　　1.1 细胞系和药物 大肠癌细胞系RKO由上海细胞研究所提供。三叶青提取物由丁刚强博士提供。 　　1.2 实验方法 取对数生长期RKO细胞，用含10%灭活小牛血清的RPIM1640培养基，于37℃、5%CO2条件下培养。用含10％小牛血清的新鲜RPIM1640培养基稀释和三叶青活性物母液（5mg/ml），使成所需浓度（5～15μg/ml），作用细胞48hrs。（1）体外细胞生长抑制试验。RKO细胞悬液（2×105/ml）分别以三个平行复孔接种于96孔板，每孔100μl。37℃培养24hrs使细胞贴壁，用含不同浓度三叶青活性物的新鲜培养基配成终体积200ul，37℃孵育68h后，每孔加50μl MTT（2mg/ml），继续培养4hrs，平板离心1000rpm×10min，弃去上清，加120μl DMSO溶解MTT结晶，平板振荡10min，570nm下Elisa读值（Wallac）。（2）DNA梯带检测。收集经5、10、15μg/ml三叶青提取物和加等量的溶剂作用48h的RKO细胞，用含50mM TrisHCL(PH7.5)，20mM EDTA和1％NP40裂解缓冲液裂解，然后加1％SDS和Rnase（5μg/ml）到上清中，56℃孵育2hrs，再加蛋白酶K（2.5μg/ml）37℃孵育2hrs。用醋酸铵（3.3M）和酒精（95%）溶解沉淀，加入上样缓冲液。DNA梯带经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色观察。（3）RTPCR检测。RKO细胞2×105/ml浓度以3个平行复孔接种于24孔板，每孔100ul（含2×104细胞），培养24h使贴壁。不同浓度三叶青活性物作用48hrs后，依次进行下列试实验：①细胞总mRNA的提取（氯仿一步法）；②紫外分光光度计测定mRNA的含量；③反转录：dNTP(each 10mmol/L)2μl、5×buffer 4μl、DTT(100mmol/L)1μl、RNAsin(40U/μL)1μl、Oligo dT(100μmol/L)1μl、总RNA2μg加水至18μl后65