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不同浓度软脂酸对INS-1细胞功能及凋亡影响 　作者：郭亚菊，莫朝晖，陈科，谢晓云 【摘要】 目的 观察不同浓度软脂酸在不同时间内对INS-1细胞功能及凋亡的影响。方法 分别将0、0.1、0.2、0.3、0.4mmol/L软脂酸与胰岛INS-1细胞6h，24h，使用MTT、流式细胞技术及RT-PCR检测INS-1细胞胰岛细胞活力、凋亡率以及胰岛素基因表达，并检测细胞胰岛素分泌量。结果 胰岛INS-1细胞在软脂酸中培养6h时，随着软脂酸浓度的增加，基础胰岛素分泌量增加(Plt;0.05)，凋亡率无明显变化，而经软脂酸干预24h时，随着软脂酸浓度的增加，胰岛INS-1细胞基础胰岛素分泌量减少，凋亡率明显增加，胰岛素基因表达减弱。结论 长期高脂损害INS-1细胞功能活性、促进β细胞凋亡。 【关键词】 软脂酸;胰岛INS-1细胞凋亡;脂毒性 肥胖是2型糖尿病重要的危险因素，两者均伴有明显的高胰岛素血症、胰岛素抵抗和脂代谢异常。2型糖尿病中糖代谢紊乱的原因之一则为脂代谢异常，因此脂毒性越来越受到重视。目前有人提出脂代谢异常开始早于血糖的升高,可能为糖尿病的始动因素,故提议将糖尿病改为“糖脂病”，但也有人认为高血糖是发生脂毒性的先决条件,若无高血糖,脂毒性也难以发生。为此，本研究观察软脂酸在不同浓度及在不同时间内对胰岛INS-1细胞功能及凋亡的影响。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料与试剂 胰岛INS-1细胞株(武汉细胞典藏中心);软脂酸(sigma公司)，胰岛素放免试剂盒(北京科美东雅生物技术公司)，RT-PCR所需试剂(华美公司)，细胞培养基(Bibico 含糖)，胎牛血清(四季青公司)。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 细胞培养与实验分组 将大鼠胰岛素瘤INS-1细胞于含10%FBS的RPMI1640完全培养基(10%胎牛血清，11.2mmol/L葡萄糖，10mmol/L Hepes，1mmol/L丙酮酸钠，50μmoL/L β巯基乙醇，100μ/ml青霉素和100ug/ml链霉素)中培养，隔天换液1次，7天传代1次，取对数生长期细胞用于实验。 　　取生长良好的INS-1细胞，接种于6孔板，培养至细胞融合60%～70%后，对照组(control)加不含软脂酸的完全培养基2ml，实验组分别加入含0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L软脂酸的完全培养基2ml，每组设4个重复孔，37°C，5%CO2条件下孵育。 　　1.2.2 胰岛素测定 各组分别于孵育6h 、24h收集上清液，-20°C保存，用放免法测定胰岛素含量。 　　1.2.3 MTT细胞活力测定 以每孔5000个细胞接种到96孔板，待细胞贴壁2天后加入PBS配置的5mg/ml的MTT 20μl，孵育4h，终止培养，吸弃上清液，加入150μl DMSO，摇床震荡10min，酶联免疫检测仪上570nm波长测定吸光值。 　　1.2.4 细胞凋亡检测 将干预完成的细胞制成单细胞悬液，1000r/min离心5min，弃上清;用4℃预冷的70%冷乙醇固定，悬起细胞，用封口膜封紧，4℃保存;调整细胞浓度为106细胞/ml，取1ml细胞悬液，用PBS洗3次，细胞重悬于1ml PI染液中，37℃孵育30min即可进行流式分析;PI染液终浓度为50μg/ml，RNase A终浓度为20μg/ml;流式细胞分析仪 MCYCLE 软件分析系统可计算正常、凋亡和死亡细胞群的百分数。 　　1.2.5 RT-PCR检测胰岛素mRNA的表达 INS-1细胞在分别经过含0mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L软脂酸的完全培养基中培养24h，用PBS洗涤2遍后，用Trizol等试剂提取总RNA，取2μl总RNA，以Oligo(dT)18primer为引物，在25μl反应体系中用AMW反转录进行反转录合成cDNA第一条链，根据INS-1细胞胰岛素cDNA序列结合，以GADPH为内参;胰岛素引物序列为：上游5’-CCAGGCTTTTGTCAAACAGCA-3’，下游5’-ACGGGACTTGGGTGTGTATAGAA-3’;GADPH引物序列为5’-TGGGTGTGAACCACGAGAA-3’，下游引物为5’-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3’;反应条件：94℃ 预变性3min; 94℃ 3 s, 54℃ 40s, 72℃ 40s,共30个循环; 72℃再延伸5min。 　　1.3 统计学处理 所有数据均重复3次以上，以x±s表示,结果应用SPSS 10.0软件处理,各组均数经方差齐性检验后,组间比较用单因素方差分析。 　　2 结果 　　2.1 不同浓度软脂酸对INS-1细胞基础胰岛素分泌影响的动态变化