丹酚酸B体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化实验探究.docVIP

丹酚酸B体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化实验探究 　 作者：徐秀梅，郭茂娟 赵旭 范英昌 【摘要】 　　目的　观察丹酚酸B(SalB)干预体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的作用及其机制。方法分离培养及鉴定大鼠MSCs，对其进行分组诱导:SalB组(终浓度为250 μg/L)、5-氮胞苷组(终浓度为10 μmol/L)、SalB联合5-aza组(终浓度分别为250 μg/L与10 μmol/L)，诱导24 h后继续培养4周，观察其形态学变化，免疫细胞化学法鉴定心肌特异性肌钙蛋白T (cTnT)的表达, 实时荧光定量RT-PCR法检测心肌早期基因NKX2.5、GATA-4、Desmin和a-actin mRNA的表达。结果诱导后的MSCs体积增大，增殖减慢，并出现肌管样结构；免疫细胞化学结果显示诱导后的MSCs表达心肌特异性蛋白cTnT，与5-aza组相比，SalB组cTnT表达较低，SalB联合5-aza组cTnT表达升高；实时荧光定量RT-PCR结果显示各组均表达心肌分化早期基因，SalB联合5-aza组诱导后的MSCs的心肌早期分化基因表达明显高于其他两组。结论SalB可在体外诱导大鼠MSCs定向分化为心肌样细胞，其与5-aza联合诱导可明显提高MSCs向心肌细胞分化的能力。 【关键词】 丹酚酸B； 骨髓间充质干细胞； 体外诱导； 免疫细胞化学； 实时荧光定量RT-PCR 　　骨髓间充质干细胞(MSCs)系自体来源,取材容易,扩增能力强,是一种体内外均有极强的分化潜能的干细胞［1］。1995年，Wakitanis等［2］发现体外分离培养的大鼠MSCs体外可被5-aza诱导分化为心肌样细胞。但5-aza作为抗肿瘤药物具有一定的毒副作用,故寻找安全、有效的诱导剂应是目前的重要课题。我们前期的研究结果表明SalB可以减小心肌梗塞的面积［3］，并能有效地促进梗塞灶内成纤维细胞的增生，加速心脏的修复过程。那么，它对有心肌分化潜能的MSCs起什么作用呢？为进一步研究其机制，我们进行了中药单体丹酚酸B(SalB)体外诱导MSCs分化为心肌样细胞的研究。现将研究结果报道如下。 　　1 器材 　　1.1 动物 　　（200±20）g体重的Wistar雄性大鼠，购于中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心，动物许可证号：scxk2005-0001。 　　1.2 试剂与仪器 　　L-DMEM培养液、1∶250胰蛋白酶、EDTA、双抗，Gibco公司；胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）,Hyclone公司；D-Hanks缓冲液； percoll淋巴细胞分离液，Pharmacia公司；CD44兔多克隆抗体〔Rabbit Anti-CD44(HCAM)〕、CD34兔多克隆抗体（Rabbit Anti-CD34）、即用型SABC免疫组化染色试剂盒，DAB显色试剂盒、PBS缓冲液，武汉博士德生物工程有限公司；小鼠抗大鼠单克隆抗体Troponin T, Cardiac Isoform Ab-3(Clone CT-3)，美国Lab vision公司；即用型SP免疫组化染色试剂盒(cat.no.MSP859143)，天津灏洋生物制品科技有限责任公司；TaqMan Reverse Transcription Reagents、SYBR Green PCR Master Mix reagent kits试剂盒(Applied Biosystems)、Trizol总RNA提取试剂，天津润泰科技发展有限公司；5％CO2恒温培养箱（model TC2323 CO2 incubator）；倒置相差显微镜（XD-101 98010）；SW-CJ-2FD型单人双面净化工作台；离心机（LDZ5-2）；UV-530紫外分光光度计(上海生物仪器厂)；PCR仪(美国HYBAID)；ABI7300实时定量PCR仪。 　　1.3 药品 　　5-aza，Sigma公司；丹酚酸B，天津天士力制药股份有限公司。 　　2 方法 　　2.1 MSCs的分离培养　 　　将大鼠脱颈处死，无菌条件下取双侧股骨、胫骨，适量D-Hank’s液冲洗骨髓，100目筛网过滤，将密度为1.073g/ml的Percoll预先置于试管的底部,然后按照1∶1的比例沿管壁缓慢滴加骨髓悬液，离心（1 800 r/min,20 min），收获位于界面层灰白色的单个核细胞,用L-DMEM离心洗涤2次（800 r/min,5 min）后接种于完全培养液（含10%胎牛血清、100 mg/L青霉素、100 mg/L链霉素的L-DMEM培养液），置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中继续培养，24 h后首次换液，以后每3 d更换1次培养液，2周后细胞长满瓶底。 　　2.2 MSCs