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人HCN4基因重组腺病毒载体构建及鉴定 　 作者：蔡军，林国生，江洪，王腾，曾彬，罗浩，郭军，李俊，汪蕾 【关键词】 腺病毒科 Construction and identification of human HCN4 gene recombinant adenovirus 　　【Abstract】 AIM: To construct the recombinant adenovirus of human HCN4 gene. METHODS: HCN4 gene fragment was cloned into the shuttle plasmid pAdTrackCMV to form the transfer vector by the methods of homogeneous recombination in bacteria and the recombinant adenovirus was then transfected into 293 cells using Lipofectamine 2000. The target gene was detected by polymerase chain reaction (PCR) and the titer and its infection rate were determined using the green fluorescent protein (GFP) expression in the shuttle plasmid. RESULTS: Restriction enzyme digestion analysis and the sequence analysis confirmed that the HCN4 gene was successfully inserted into the adenovirus vector. The titer of the recombinant adenovirus was 2.0×1015 pfu/L. GFP was observed in the transfected 293 cells under a fluorescent microscope. CONCLUSION: The recombinant adenovirus containing human HCN4 gene is successfully constructed by the method of homogeneous recombination in bacteria. 　　【Keywords】 HCN gene; adenoviridae; recombination, genetic 　　【摘要】 目的： 构建超极化激活环核苷酸门控通道基因（HCN4）重组腺病毒载体. 方法： 采用基因工程技术，将HCN4 cDNA定向克隆至穿梭载体pAdTrackCMV中，利用pAdeasy1系统进行细菌内同源重组后，脂质体转染293T细胞包装、扩增，CsC1密度梯度超速离心纯化. 采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定，利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因，对病毒滴度和感染效率进行监测. 结果： 测序结果证明成功构建了HCN4基因重组腺病毒载体，病毒滴度达2.0×1015pfu/L. 结论： 应用细菌内同源重组法成功构建了含人HCN4基因的重组腺病毒载体. 　　【关键词】 HCN基因；腺病毒科；重组，遗传 　　0引言 　　起搏电流（If）在窦房结生理性起搏机制中担当重要角色，同时也是自主神经调节心脏节律的主要靶点，其编码基因为超极化激活环核苷酸门控通道基因（HCN）［1-4］. HCN超家族包括HCN1～HCN4型，其中HCN4占窦房结HCN总mRNA的80%［5］. 最近研究发现，在家族性或遗传性窦房结功能障碍家系中存在HCN4 D553N或1613delC位点突变［6,7］. 为了进一步深入研究HCN4的通道动力学及其在起搏活动中的功能角色，积极开展窦房结功能障碍的基因治疗，我们构建了表达HCN4的重组腺病毒载体. 　　1材料和方法 　　1．1材料 　　腺病毒细菌内同源重组系统包括E.coli Bj5183、穿梭质粒pAdTrackCMV及腺病毒骨架质粒pAdeasy1（美国Johns Hopkins大学Dr. He TC惠赠）；293细胞系（武汉大学细胞典藏中心）；各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、RNase A（TaKaRa公司）；转染试剂Lipofectamine 2000（Gibco BRL）；PCR产物回收纯化试剂盒（Promega公司）；质粒提取试剂盒（Hispeed Plasmid