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人GM-CSF基因真核表达载体构建及表达 　【摘要】 【目的】 构建以基因佐剂hGM-CSF基因为基础的真核表达质粒pIGM-CSF，并在宫颈癌细胞HeLa中表达与鉴定。【方法】 采用聚合酶链反应从载体pORF-hGM-CSF中，扩增出hGM-CSF基因，克隆到双顺反子真核表达载体pIRES的多克隆位点B(MCSB)中，构建pIGM-CSF真核表达载体。然后采用脂质体转染法将其转染HeLa细胞，用RT-PCR在RNA水平和ELISA在蛋白水平检测其在真核细胞中的表达。【结果】所克隆hGM-CSF基因片段经测序完全正确；重组质粒转染Hela细胞后，检测有hGM-CSF表达。【结论】 成功构建含基因佐剂真核表达载体pIGM-CSF，并在宫颈癌细胞中能有效表达，为继续克隆目的抗原从而构建双顺反子真核表达质粒奠定了基础。 【关键词】 真核表达载体； hGM-CSF； 基因佐剂； 双顺反子 Abstract: 【Objective】 To construct eukaryotic expression plasmid pIGM-CSF based on gene adjuvant hGM-CSF, and express in Hela cells. 【Methods】 Plasmid pORF-hGM-CSF was used as template to amplify hGM-CSF gene by PCR, and the product was inserted into multiple cloning sites B of bicstronic eukaryotic expression vector pIRES to construct eukaryotic expression plasmid pIGM-CSF, then transfected into Hela cell by using liposome. Finally, the hGM-CSF gene expression of protein was detected by RT-PCR from RNA level and ELISA from protein level. 【Results】 The length and sequence of the cloned hGM-CSF segment was correct. The hGM-CSF gene could be expressed in transfected Hela cells.【Conclusion】 The eukaryotic expression plasmid pIGM-CSF containing gene adjuvant was successfully constructed and expressed in Hela cells effectively, lays a foundation on constructing bicstronic eukaryotic co-expression plasmid. Key words: eukaryotic expression plasmid; hGM-CSF; gene adjuvant; bicstronic 目前对DNA疫苗的研究已经成为热点，一些研究表明DNA疫苗对许多病毒[1,2]、细菌[3]、寄生虫［4］、肿瘤[5]和慢性退行性疾病[6]等有预防和治疗作用，还可以调节自身免疫应答。HIV、疟原虫和病人独特型DNA疫苗等已进入人体临床试验[7]，但是核酸疫苗的免疫效果在不同动物个体中差异较大，有些疫苗在小个体的动物中免疫和保护效果较好，而在大个体动物中效果较差。某些肿瘤及病毒的T、B细胞表位抗原性弱，难以诱导有效的T、B细胞免疫应答。基因佐剂(gene adjuvant)可将某些细胞因子编码基因与目的基因克隆到同一载体或不同载体共同免疫动物，其表达的相应蛋白起到佐剂作用，可大大增强T、B细胞的免疫应答水平。为此，我们构建以基因佐剂人粒细胞-吞噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, hGM-CSF)为基础的真核表达载体pIGM-CSF，为今后在该载体上克隆我们所需的目的抗原基因奠定了基础。 1 材料与方法 1.1 质粒与菌株 大肠杆菌 DH5α 和宫颈癌细胞 Hela 为本实验室保存；载体 pIRES 购自 BD Biosciences Clontech 公司，质粒 pORF-hGM-CSF 购自 InvivoGen 公司。 1.2 主要试剂 Ex Taq DNA聚合酶，T4 DNA 连接酶，限制性内切酶XbaⅠ