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人TSHR膜外区cDNA克隆及真核表达载体构建 　 作者：武敏，施秉银，伍丽萍，兰玲，吴小燕，张进安，徐莉 【摘要】 目的 通过生物技术获得促甲状腺激素受体膜外区表达载体，为TSHR膜外区的研究提供有力工具。方法 从人甲状腺组织中提取总RNA，RTPCR分离得到TSHR膜外区cDNA，双酶切后插入真核表达载体pcDNA3.1(+)。结果 经酶切鉴定、测序分析表明TSHR膜外区片段与GenBank提供的完全相同。结论 成功构建了人TSHR膜外区真核表达载体。 【关键词】 人TSHR膜外区；RTPCR；真核表达载体 在自身免疫性甲状腺疾病(autoimmune thyroid disease, AITD)发病过程中，促甲状腺激素受体(thyrotropin receptor, TSHR)是重要的自身抗原[1]，机体产生针对TSHR的自身抗体(thyrotropin receptor antibody, TRAb)是其主要的发病机制。由于存在于甲状腺细胞膜上的TSHR数量少，结构不稳定，且难以纯化，无法开展TSHR的进一步研究。本文从人甲状腺中提取RNA，通过逆转录获得TSHR膜外区cDNA，构建真核表达载体，建立了有效的TSHR体外表达系统。 　　1 材料与方法 　　1.1 组织来源和实验材料 　　甲状腺组织来源于已确诊的Graves手术患者。DH5α感受态细菌购于北京鼎国生物技术有限公司，pMD18T克隆载体系日本TaKaRa公司产品，真核表达载体pcDNA3.1(+)系美国Invitrogen公司产品。RNAgents Total RNA Isolation System和Accesss RTPCR System为Promega公司产品，质粒提取及凝胶回收试剂盒为上海博亚生物公司产品。 　　1.2 PCR引物的设计合成 　　根据文献报告人促甲状腺激素受体cDNA 序列资料[2]，由上海华诺生物科技有限公司设计并合成一对用于扩增 hTSHR 膜外区cDNA 编码区的寡核苷酸特异性引物：上游引物为5′ATTGGATCCAACATGGATATGAGGCCGGCGGACTT GCT3′，下游引物为5′GCCGAATCCCTACTTGTAGCCCATTATGTCTTCACAC3′。 　　1.3 总RNA的提取 　　冻存的约100mg甲状腺组织在盛有液氮的研钵中充分破碎，研磨成匀浆，按试剂盒说明逐步加入裂解液醋酸钠、酚氯仿异丙醇，抽提组织中的总RNA，经乙醇漂洗后溶于无RNA酶灭菌去离子水。利用分光光度器测定RNA的A260和A280值。 　　1.4 RTPCR及产物的纯化 　　RNA样品预处理于75℃变性5min后速放冰上冷却。RTPCR反应体系：AMV反转录酶(5u/μL)1μL，Tfi DNA聚合酶(5u/μL)1μL，5×AMV/Tfi Buffer 10μL，上下游引物各3μL，最后混合RNA样品加无RNA酶灭菌去离子水至50μL。混匀后置PCR仪上，逆转录反应条件设为：48℃逆转录60min，94℃预变性2min。PCR反应条件为：94℃变性30s，60℃退火60s，68℃延伸270s，45个循环后，68℃终延伸10min。对RTPCR产物经乙醇沉淀法进行纯化浓缩。 　　1.5 克隆质粒的构建 　　根据TA克隆原理[3]将TSHR膜外区片段插入pMD18T克隆载体。将TSHR膜外区(thyrotropin receptor ectodominant, ETSHR)片段3μL(约75ng DNA)，pMD18T克隆载体1μL(约50ng DNA)，T4 DNA连接酶0.5μL，10×连接酶缓冲液5μL，加去离子水至10μL，至PCR仪上16℃过夜。将连接产物转入DH5α细菌，经IGTP/Xgal平皿(Amp+)筛选，挑选单个白色菌落，放入10mL LB培养液中，37℃振摇过夜。碱裂解法提取重组质粒，双酶切法筛选携带目的片段的阳性克隆子并纯化。 　　1.6 真核表达载体的构建及鉴定 　　将上一步提纯的pMD ETSHR重组质粒双酶切后，定向插入pcDNA3.1(+)质粒。反应体系为pMD ETSHR重组质粒5μL，10×K Buffer 2μL，BamHⅠ和EcoRⅠ各1μL，加水至10μL。将酶切体系37℃过夜，65℃ 15min使灭活内切酶。经凝胶电泳后分离目的片段ETSHR，提纯浓缩后加入真核表达载体pcDNA3.1(+)，再建立连接体系。连接产物导入感受态细胞，涂于琼脂平板(Amp+)，挑选阳性克隆，酶切电泳分析，并送上海华诺生物科技公司鉴定。 　　　2 结 果 　　2.1 RTPCR产物的鉴定 　　电泳后发现，在Mark标记约1500bp处存在单一条带，特异性好，无其他扩增产物出