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人白介素24 cDNA克隆、突变纠正及原核表达 　 作者：魏丽丽，李成华，袁成福，陈济，丁嵩涛，刘革力，易发平，宋方洲 【摘要】 目的 获取人白介素24(IL24)cDNA，构建原核表达载体以表达含有谷胱甘肽S转移酶(GST)的融合蛋白GSTIL24。方法 以人外周血单核细胞(PBMC)总RNA为模板，RTPCR扩增IL24 cDNA，克隆入原核表达载体pGEX4T2，测序结果显示在IL24 cDNA第223位G→A，370位T→C，从而导致其编码蛋白的氨基酸发生改变：A75T，H124Y，通过二次PCR将其纠正，重组载体pGEXIL24转化大肠杆菌BL21(DE3)，异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，SDSPAGE，Western blot检测显示有融合蛋白GSTIL24表达。结果 通过RTPCR及二次PCR得到人IL24 cDNA，构建其原核表达载体，经IPTG诱导在相对分子量约为50 000处有融合蛋白表达。结论 IL24的重组载体在大肠杆菌BL21(DE3)可以表达GSTIL24融合蛋白。 【关键词】 白介素24；二次PCR；突变纠正；融合蛋白；克隆；原核表达 白细胞介素24(interleukin24, IL24)是1995年由美国哥伦比亚大学的Jiang等[1]研究发现的，它能选择性地抑制广谱癌细胞生长，促进凋亡，并具有一定的免疫调节能力。经复制缺陷腺病毒携带的IL24已经进入II期临床试验，研究结果显示：疗效显著而毒副作用很少[2]。因此，IL24有望成为肿瘤基因治疗的一种新的候选基因。我们拟通过RTPCR方法获取IL24 cDNA，构建其原核表达载体，并诱导其表达，为进一步的研究奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　大肠杆菌E.coli DH5α，E.coli BL21(DE3)为本室保存。pGEX4T2(4970bp)购自Amersham公司。淋巴细胞分离液购自鼎国公司。Trizol，BamHⅠ，XhoⅠ，pyrobestTM DNA polymerase，DNA连接试剂盒,引物的合成和重组质粒测序由TaKaRa公司完成。RT试剂盒购自TOYOBO公司。DNA marker、小量质粒纯化抽提试剂盒和胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。小分子量蛋白marker购自博大泰克公司。抗谷胱甘肽S转移酶(glutathione S transferase,GST)抗体及其二抗购自Merck公司。 　　1.2 IL24的基因克隆 　　通过淋巴细胞分离液分离健康人静脉血的外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)，用Trizol提取其总RNA,通过RTPCR扩增IL24 cDNA，RT反应体系： 2μL RNA，1μL olig dT(20)，9μL RNasefree dd H2O 70℃ 5min，冰浴10min，再加入4μL 5×RT buffer，2μL dNTPs， 1μL RNase inhibitor，1μL莫洛尼鼠白血病病毒(moloney murine leukaemia virus, MMuLV)反转录酶30℃ 10min，42℃ 20min，99℃ 10min。根据GenBank中人IL24基因序列(登录号：NM 006850)通过DNAStar软件设计IL24引物，并在引物的5′端引入酶切位点，上游引物a：5′CGGGATCCATGAATTTTCAACAGAGGCTG3′，下游引物b：5′CCGCTCGAGCTAGACATTCAGAGCTTGTAG3′(划线部分分别为BamHⅠ和XhoⅠ的酶切位点)，管家基因G3PDH (glyceraldehyde 3phosphate dehydrogenase)引物序列：Primer R：5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA3′；Primer F：5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′，扩出的片段长450bp。PCR反应体系：ddH2O 8.4μL，10×PCR buffer 2μL, dNTPs(2.5mmol/L)1.6μL，引物a、b各2μL，PrimerR、 F各0.4μL，cDNA 3μL，DNA聚合酶0.2μL，94℃ 5min，94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min (30)，72℃ 10min。 　　1.3 原核表达载体的构建 　　将PCR产物和pGEX4T2载体分别用BamHⅠ/XhoⅠ双酶切，胶回收试剂盒纯化，TaKaRa连接试剂盒连接16℃ 30min，转化E.coli DH5α感受态，酶切鉴定，将阳性克隆送TaKaRa公司测序