兔骨髓间充质干细胞体外培养及生物学特性探究.docVIP

兔骨髓间充质干细胞体外培养及生物学特性探究 　【摘要】 目的：进一步研究兔骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）分离和培养方法及其生物学特性，为利用 MSCs 作为种子细胞治疗多种疾病提供实验基础。方法：通过密度梯度离心、贴壁筛选法分离培养兔 MSCs。测定其接种贴壁率，在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化，利用甲基噻唑基四唑（methyl thiazdyl tetrazolium, MTT）法测 定 MSCs 生长曲线，并应用流式细胞术测定细胞表面标记物。结果：MSCs 接种 12 h 后贴壁率为 95% 以上，细胞倍增时间约为 30.8 h，平均传代时间约 5~7 d；培养的 MSCs 阳性表达 CD29、CD44、CD105，阴性表达 CD34。结论：在适宜的实验条件下，体外培养的 MSCs 能够稳定生存增殖并保持多向分化潜能，可作为组织工程的种子细胞。 【关键词】 骨髓间充质干细胞；生物学特性；细胞培养 The Biological Characteristics and Culture in Vitro of Rabbit Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells 〔Abstract〕 ObjectiveTo further study the isolation and cultivation procedures of mesenchymal stem cells from rabbit in vitro, and explore their biological properties. To build an experimental basis on applying MSCs as seed cells to treat many diseases. Methods MSCs were obtained from tibias by density gradient centrifugation and were tested the rate of adhesion. The configuration was observed under phase-contrast microscope consecutively and the cell growth was measured by MTT method. Cell cycle and surface antigens were detected through flow cytometer. Results The subcultured cells showed active proliferative ability. More than 95% of subceltured MSCs were adhesive in 12 h. MSCs were positive for CD29, CD44, CD105 and negative for CD34. Conclusion In present culture condion, MSCs showed stable and rapid growth in vitro . The characteristics make it possible to MSCs to be the seed cells for tissue engineering. 〔Key Words〕 Mesenchymal stem cells; Biological characteristics; Cell culture 　　干细胞是具有自我更新能力，且在适宜微环境下具有多系分化潜能的原始细胞[1]。近年研究发现，机体内除胚胎干细胞外还存在具有自我更新和分化能力的成体干细胞。其中骨髓中的干/粒细胞包括间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSCs），造血干细胞及网状内皮系统。 MSCs 可在体外扩增并有多向分化潜能[2-4]， 且取材方便，免疫耐受性、遗传背景稳定及易于转染外源基因等，因而作为组织工程“种子细胞”有“广泛的应用前景”[5-8]。本实验通过对兔 MSCs 体外培养法及其生物学特性进行研究，以建立一套稳定、成熟的兔 MSCs 培养方法，从而为细胞移植等组织工程提供种子细胞来源提供实验基础。 1 材料及方法 1.1 主要试剂与仪器 低糖 DMEM 培养基（GIBICO 公司）、10% 胎牛血清（Hyclone 公司）、0.125% 胰蛋白酶（Sigma 公司）、Ficoll 淋巴细胞分离液（上海华精生物高科技有限公司，比重 1.077 g/mL）、CD29、CD34、CD44、CD1