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几丁质酶抑制化合物产生菌筛选浅谈 　 ; 作者：谢洁　周泽扬　张新军 蓝希钳 胡军华【关键词】; 几丁质酶；,抑制化合物；,产生菌 摘要： 从采自全国的200多份土样中分离出1350多株菌，利用平板透明圈法和铁氰化钾方法，以家蚕中肠几丁质酶作为靶标，从这些菌株中筛选出家蚕几丁质酶抑制化合物的产生菌1237#，经初步鉴定该菌株为假单胞菌。本文主要介绍几丁质酶抑制化合物筛选体系的建立、活性物质性质的初步探索及目的菌株的鉴定。　　关键词： 几丁质酶； 抑制化合物； 产生菌　 ; Preliminary screening of chitinase inhibitor producing strains ABSTRACT In the course of screening for new chitinase inhibitor, using the silkworm chitinase as a target, and transparent inhibition zone plate assay and potassium ferricyanide method, a strain belonging to the Pseudomonas, named#1237 was isolated among 1350 strains from 200 soil samples. The screening procedure and the preliminary study of the culture were also reported.　KEY WORDS Chitinase; Inhibitor; Producingstrain ;几丁质是甲壳类动物、昆虫外骨骼和真菌细胞壁的重要组成成分，它是N乙酰葡萄糖胺以β1，4键连接起来的直链多聚物。几丁质在自然界中的存在量仅次于纤维素位居第二。几丁质酶是一类能把几丁质降解为N乙酰胺基葡萄糖或寡聚N乙酰胺基葡萄糖的水解酶。真菌需要几丁质酶降解子母细胞之间的隔以完成其生殖过程；昆虫发育过程中也需要几丁质酶部分降解外骨骼以完成其变态发育的过程，因此在真菌生殖阶段和昆虫蜕皮阶段其体内几丁质酶的活性显著增高。由于几丁质酶在真菌出芽生殖和昆虫蜕皮过程中发挥了极为重要的作用，这就使得几丁质酶可能成为生物杀虫剂和抗真菌药物专一性作用的靶目标。同时由于哺乳动物不以几丁质代谢作为生命活动必需系统［1］，故以几丁质酶作为靶目标的生物杀虫剂和抗真菌药物具有对人畜无害的优点。至今已报道的几丁质酶抑制剂主要有：Allosamidin［2］、 Argifin［3］、Argadin［3］、Demetyallosamidin［4］等。长期以来日本等国一直在进行几丁质酶抑制化合物的研究，但国内至今未见与几丁质酶抑制化合物相关的研究报告。本研究旨在从我国丰富的微生物资源中获得具有自主知识产权的新型几丁质酶抑制化合物及其生产菌株，为开发具有新型作用点的杀虫抗真菌药物奠定基础。 ; 1 材料与方法 ; 1.1 培养基 ; 1.1.1 平板培养基 PDA培养基。 ; 1.1.2 液体培养基(%) 葡萄糖1，蛋白胨02，牛肉膏01，酵母提取物01，Fe2(SO4)3 0001，pH72。 ; 1.1.3 几丁质酶抑制化合物的筛选平板(%) MgSO4 005，KH2PO4 005，KCl 005，FeSO4#12539;7H2O 001，ZnSO4#12539;7H2O 01，胶体几丁质1，琼脂粉12，pH72。 ; 1.2 几丁质酶粗酶 提取家蚕初蛹中肠液，经硫酸铵盐析、透析后冻干保存备用；几丁质由日本信州大学下板诚教授赠送；胶体几丁质：利用盐酸处理几丁质制备［5］。 ; 1.3 活性菌株的液体培养方法菌体接种于液体培养基，37℃振荡培养6d，培养液8000r/min离心10min，取上清检测活性。 ; 1.4 几丁质酶抑制物的检测方法 ; 1.4.1 平板透明圈法 将几丁质粗酶配成01g/ml的几丁质粗酶液(以后提到的酶液均是按此法配成)，把酶液与筛选菌株培养液按1∶2的比例混合，在几丁质酶抑制化合物筛选平板上打孔，取混合液50μl加样于孔中，观察平板透明圈的大小。在检测过程中以蒸馏水、缓冲液和液体培养基作为空白对照。几丁质酶抑制化合物筛选平板含有胶体几丁质和无机盐。在平板上打孔加入酶液，几丁质酶能分解平板中的胶体几丁质而产生透明圈。用相同量的酶液与检测液混合时，透明圈变小表明酶的活性受到抑制，透明圈越小表明受抑制的程度越高。这种方法能够直观、快捷地筛选出几丁质酶抑制化合物。 ; 1.4.2 铁氰化钾方法［7］500μl胶体几丁质加入100μl酶液、不同测试培养液或对照液和pH72磷酸盐缓冲液(测试液体与缓冲液总体积为1