哮喘大鼠孤束核内H3受体对呼吸道 P物质样免疫反应物影响.docVIP

哮喘大鼠孤束核内H3受体对呼吸道 P物质样免疫反应物影响 　【摘要】 目的：探讨大鼠孤束核(NTS)内组胺H3受体对哮喘发作时呼吸道内神经源性炎症介质P物质（SP）含量的影响。方法：取健康雄性SD大鼠成功制备哮喘模型后诱发哮喘急性发作，采用中枢立体定位及核团微量注射技术，分组依次向NTS内微量注射无菌生理盐水、H3受体激动剂RMHA以及其拮抗剂Thio，利用肺内SP特异性抗血清、免疫组化法（SABC法）、葡萄糖氧化酶DAB镍染色和计算机图像分析等技术检测肺内SP的含量。结果：和对照组相比较，哮喘大鼠NTS内微量注射1 μg RMHA，肺内SP样免疫反应物（SPRIL）阳性数量显著减少、阳性密度降低，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；如果在哮喘大鼠NTS内注射Thio 5 μg，则可拮抗RMHA的上述效应。结论：大鼠NTS内H3受体参与减少哮喘发作时神经源性炎症介质SP的释放，从而可能抑制哮喘发作。 【关键词】 大鼠； 孤束核； H3受体； 哮喘； P物质 气道神经源性炎症在哮喘发病中的强大致病作用正日渐引起研究者的重视。非肾上腺素能非胆碱能神经（nonadrenergic noncholinergic,NANC）分布于气道管壁各层，其末梢释放速激肽类炎症介质，能引起支气管痉挛、血浆渗漏、黏膜水肿等呼吸道病理变化，与哮喘发病关系密切［1］。P物质（substance P，SP）是NANC神经纤维末梢释放的主要神经源性炎症介质。哮喘发作时，外周血、痰液和肺组织中的SP都明显增多［2］，同时肺内SP能免疫反应纤维数目和分布状态均发生非常明显的变化［3］。因此肺内感觉神经末梢SP释放增多可能是哮喘发病中的重要环节。如何降低SP等神经源性炎症介质对气道的损伤，是抑制或消除哮喘慢性气道炎症的一个突破口。组胺H3受体是一种新型突触前调制受体，能调控多种神经递质的释放。研究初步表明，存在于外周神经末梢的组胺H3受体通过调控递质释放在一定程度上能缓解哮喘。而广泛分布在中枢神经系统内的H3受体与哮喘气道炎症发生的关系尚未见文献报道。本研究以核团给药方式结合免疫组化方法，初步探讨孤束核(nucleus tractus solitarius,NTS) H3受体与哮喘神经源性炎症的关系，为揭示哮喘发病机制以及开发有效的抗哮喘药物提供实验依据。 1 材料与方法 1.1 哮喘模型制备 雄性成年SD大鼠24只，体重250～300 g，由东南大学实验动物中心提供，在安静、温暖（18～25 ℃）、避强光、明暗周期为10 h/14 h实验室预饲养1周后，随机分成哮喘模型组（n=18）和生理盐水对照组（NS组，n=6）。于实验第1天，每只模型组大鼠腹腔注射用卵蛋白（OVA）粉末100 mg、氢氧化铝干粉100 mg、灭活百日咳杆菌5×109个配成的混悬液1 ml 1次，自第15天开始用超声雾化器雾化吸入1%OVA生理盐水溶液（2～3 ml·min-1，颗粒直径≤5 μm），每天1次，每次均以哮喘症状出现（烦躁不安、呼吸急促、用力呼吸、呼吸困难、喘息、腹肌明显收缩、咳嗽等）作为指标，连续3 d。NS组大鼠在致敏和吸入激发阶段均以生理盐水代替OVA混悬液，吸入时间为同批哮喘模型组鼠最长诱喘时间。 1.2 核团定位和给药方法 模型大鼠乌拉坦（1 g·kg-1，ip）麻醉后，将鼠头固定于立体定位仪上，参照PaxinonsWatson大鼠脑立体定位图谱，以前囟为零点，定位左侧NTS（AP:-12.80 mm；L:1.2 mm；H:8.0 mm）。在给药部位借助立体定位仪预先埋一外径为0.78 mm的不锈钢管作为注射引导管，用502胶固定。用外径0.38 mm的不锈钢管作为注射管，注射管长于引导管0.5 mm，用一细聚氯乙烯管将注射管和微量注射器相连，将注射管插入引导管中准备给药。给药体积均为1 μl，用微量注射机恒速(1 μl·min-1)注射，注射后留管2 min。其中组胺H3受体激动剂Ramethylhistamine (RMHA，Sigma公司)临用前用无菌生理盐水配制成1、2 μg·μl-1；组胺H3受体拮抗剂thioperamide(Thio,Sigma公司)用无菌生理盐水新鲜配制成10 μg·μl-1，pH 7.2～7.4，低温保存，注射前置于37 ℃水浴箱中加温。 实验结束后用相同给药法在原点注射等体积美蓝后，将大鼠头浸泡在10%的甲醛液内，7 d后冰冻切大鼠脑片(40 μm)，查找注射点，对照大鼠脑图谱确定注射部位，凡未打中NTS的实验动物均剔除。 1.3 实验分组 将已成功制备的哮喘模型大鼠按NTS处注射不同药物再随机分为哮喘组（OVA+NS组）、OVA+RMHA组、OVA+Thio组3组，每组6只，3组在静脉注射OVA溶